カエモルハブ炎エレガンスにおける細胞構造と器官形態学の研究に関する定量的アプローチ
Summary
本研究では、自由に利用可能な画像処理ツールを用いて、C.エレガンスにおけるシナプスサイズと局在化、筋肉形態、ミトコンドリア形状の定量的測定を概説する。このアプローチにより、C.エレガンスにおける将来の研究は、遺伝的変異の結果としての組織および小器官構造変化の程度を定量的に比較することを可能にする。
Abstract
疾患の根底にある細胞機構を定義することは、新しい治療法の開発に不可欠です。これらのメカニズムを解明するために頻繁に使用される戦略は、候補遺伝子の突然変異を導入し、組織および細胞小器官の形態の変化を定性的に記述することです。しかし、定性的記述は微妙な表現の違いを捉えず、集団内の個人間の表現型の変動を誤って表現し、しばしば主観的に評価される。ここで、市販のバイオ画像処理ソフトウェアと組み合わせたレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて線虫ケートカエノルハブ炎エレガンスにおける組織および小器官の形態を研究する定量的アプローチについて説明する。シナプスの完全性(サイズと統合蛍光レベル)、筋肉の発達(筋肉細胞サイズとミオシンフィラメントの長さ)、およびミトコンドリア形態(円形およびサイズ)に影響を与えるフェノタイプの定量的分析を行った。これらの細胞構造に対する遺伝子変異の影響。これらの定量的アプローチは、線虫内の他の組織および小器官の形態を容易に定量的に評価するために容易に使用することができるので、ここで説明する用途に限定されない。
Introduction
線虫カエオルハブ炎エレガンス(C.エレガンス)は、ヒト疾患に関与する生物学的および分子過程を明らかにするモデルシステムとしてますます利用されている。成虫線虫は体長がわずか1mm以上で、最大300個の卵1個の大きな雄鶏を作り出すことができます。孵化後、C.エレガンスは成人に達するために3〜4日しか必要とし、約2〜3週間2週間生きる。培養の容易さのために、C.elegansは現在、ヒト疾患の治療法を同定するために費用対効果の高い、迅速な薬物スクリーニングを行うための生体内動物モデルの中で最も人気のあるモデルの1つである。さらに、その遺伝的保全、よく定義された行動パラダイム、蛍光または光顕微鏡のための透明な体、および遺伝子操作の容易さは、遺伝子変異の細胞および分子の結果の研究を容易に達成可能にする3. C. エレガンスゲノムは、約60-80%のオルソロジーをヒト遺伝子と共有し、それらの遺伝子の約40%が疾患に関連することが知られています。C.エレガンスでモデル化され、研究されているヒト疾患には、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、シャルコット・マリー・トゥース病)、筋肉関連疾患()デュシェンヌ筋ジストロフィー)、および代謝疾患(高血糖)2、4.ほとんどのヒト障害では、疾患誘発性細胞および小器官の局在化および形態的変化が起こり、線虫モデルで容易に評価することができる。
蛍光マーカーは、顕微鏡下での動的可視化のための組織や小器官の標識に広く使用されています。しかし、C.エレガンスでは、遺伝的変異による形態的不規則性を評価する従来の方法は、主に視覚的記述に依存している。定性評価は、より広い範囲の方が意味線の記述(シナプス形態、GFPの束、特定の軸線形状、筋線維の厚さなど)をカバーし、形態学的変化の鳥の目のビューを提供することができますが、それらはあまり適していません。異なるグループ間の小さなバリエーションを比較します。さらに、定性的評価は視覚的、主観的な評価に基づいており、形態学的異常の過度または過少評価につながる可能性があります。最後に、定性的な観測値は個人によっても大きく異なり、データレプリケーションが困難になります。
近年、画像を定量的に分析できる、ユーザーフレンドリーで容易に利用できる計算アルゴリズムが数多く開発されている。しかし、このような画像解析ソフトウェアの利用は、特に体壁の筋肉やミトコンドリアに関連する形態学的研究に対して、C.エレガンスの研究に遅れをとっている。C.エレガンスの基礎構造解析を改善するために、容易に入手可能なオープンソース画像解析ソフトウェアの一部は、筋肉ミトコンドリア、体壁筋およびシナプスに対する遺伝子変異の影響を定量的に比較するために試みられた。形態。これらの実験手順は、これらのプログラム(フィジー、ilastik、CellProfiler、SQUASSH)を使用してシナプスサイズとシナプスタンパク質の局在化、体壁の筋肉面積と繊維長、およびミトコンドリアサイズの変化を評価する方法を詳細に概説します。線虫の遺伝的変異の結果としての循環性。
Protocol
Representative Results
Discussion
形態学的変動は、顕著な差異を手動でカウントするか、または任意の閾値を使用して、野生型表現型と比較して欠陥を決定することにより、しばしば評価されてきた。しかし、最近では、形態学の比較研究に定量的な方法が用いられ、細胞レベルと細胞内レベルの変化を公平に測定・記述することが求められている。フェノタイプ間の微妙でありながら生物学的に関連する違いを特定する能?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、貴重な議論と入力のためのノイマンラボのメンバーに感謝します。いくつかの株は、研究インフラプログラム(P40 OD010440)のNIHオフィスによって資金提供されているCGCによって提供されました。著者らは、C.エレガンスに関する豊富な情報に関するWormBaseに感謝し、モナッシュ大学モナッシュマイクロイメージングに関するインストルメンテーション、トレーニング、技術サポートの提供を認めています。この研究は、CMTAA研究助成金(2015年と2018年)、NHMRCプロジェクト助成金1101974および1099690によってB.Nに授与されました。
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
Referências
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