Kvantitativa metoder för att studera cellulära strukturer och organell morfologi i Caenorhabditis elegans
Summary
Denna studie beskriver kvantitativa mätningar av synaptisk storlek och lokalisering, muskelmorfologi, och mitokondriell form i C. elegans med fritt tillgängliga bildbehandlingsverktyg. Detta tillvägagångssätt möjliggör framtida studier i C. elegans att kvantitativt jämföra omfattningen av vävnad och organell strukturella förändringar som ett resultat av genetiska mutationer.
Abstract
Att definiera de cellulära mekanismerna bakom sjukdomen är avgörande för utvecklingen av nya Therapeutics. En strategi som ofta används för att riva upp dessa mekanismer är att introducera mutationer i kandidatgener och kvalitativt beskriva förändringar i morfologin av vävnader och cellulära organeller. Men kvalitativa beskrivningar kan inte fånga subtila fenotypiska skillnader, kan förvränga fenotypiska variationer mellan individer i en population, och ofta bedöms subjektivt. Här beskrivs kvantitativa metoder för att studera morfologin av vävnader och organeller i Nematoden Caenorhabditis elegans med hjälp av laserscanning konfokalmikroskopi kombinerat med kommersiellt tillgängliga bio-bildbehandlingsprogram. En kvantitativ analys av fenotyper som påverkar synaps integritet (storlek och integrerad fluorescens), muskelutveckling (muskel Cellstorlek och myosin glödtrådens längd), och mitokondriell morfologi (cirkularitet och storlek) utfördes för att förstå effekterna av genetiska mutationer på dessa cellulära strukturer. Dessa kvantitativa metoder är inte begränsade till de tillämpningar som beskrivs här, eftersom de lätt kan användas för att kvantitativt bedöma morfologin av andra vävnader och organeller i Nematoden, liksom i andra modellorganismer.
Introduction
Nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) utnyttjas alltmer som modellsystem för att avslöja biologiska och molekylära processer som är involverade i människans sjukdom. En vuxen Nematoden har en kroppslängd på drygt 1 mm, och kan producera en stor kull på upp till 300 ägg1. Efter kläckningen, C. elegans kräver bara 3-4 dagar att nå vuxen ålder, och leva i cirka 2 till 3 veckor2. På grund av dess enkla odling, är C. elegans för närvarande en av de mest eftertraktade in vivo djurmodeller för att genomföra kostnadseffektiv, snabb drog screening för att identifiera Therapeutics för mänskliga sjukdomar. Dessutom, dess genetiska bevarande, väl definierade beteendemässiga paradigm, transparent kropp för fluorescens eller ljus mikroskopi, och enkel genetisk manipulation göra studiet av cellulära och molekylära konsekvenserna av genetiska mutationer lätt achieveable 3. C. elegans Genome aktier cirka 60-80% ortologi med mänskliga gener, och cirka 40% av dessa gener är kända för att vara sjukdomsrelaterade. Några av de mänskliga sjukdomar som har modellerats och studerats i C. elegans inkluderar neurodegenerativa sjukdomar (Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateralskleros, Charcot-Marie-Tooth sjukdom), muskelassocierade sjukdomar ( Duchennes muskeldystrofi) och metabola sjukdomar (hyperglykemi)2,4. I de flesta mänskliga sjukdomar, sjukdomsinducerad cellulära och organell lokalisering och morfologiska förändringar sker, som lätt kan utvärderas i Nematoden modellen.
Fluorescerande markörer har använts i stor utsträckning för att märka vävnader och organeller för dynamisk visualisering under mikroskopet. I C. eleganshar dock konventionella metoder som bedömer morfologiska oegentligheter på grund av genetiska mutationer till stor del förlitat sig på visuella beskrivningar. Även kvalitativa bedömningar kan omfatta bredare intervall av fenotypiska beskrivningar (synaptisk morfologi, GFP clumping, specifik axonal form, muskelfiber tjocklek, etc.) och ge en fågelperspektiv av de morfologiska förändringarna, de är mindre lämpade för jämföra små variationer mellan olika grupper. Dessutom baseras kvalitativa bedömningar på visuell och subjektiv utvärdering, vilket kan leda till över-eller underskattningar av morfologiska avvikelser. Slutligen kan kvalitativa observationer också variera kraftigt mellan individer, vilket skapar problem med datareplikering.
Under de senaste åren har ett antal användarvänliga och lättillgängliga beräkningsalgoritmer som kvantitativt kan analysera bilder utvecklats. Emellertid, utnyttjandet av sådan bildanalysprogram vara för vissa morfologiska studier, särskilt i förhållande till kroppen väggen muskler och mitokonen, i C. elegans forskning har släpat efter. För att förbättra den underliggande strukturella analysen i C. elegans, några av de lättillgängliga, öppen källkod bildanalysprogram vara trialed att kvantitativt jämföra effekterna av genetiska mutationer på muskel mitokondrier, organ vägg muskler och synaptiska Morfologi. Dessa experimentella förfaranden skissera i detalj hur dessa program (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan användas för att utvärdera förändringar i Synaptic storlek och Synaptic protein lokalisering, kropp vägg muskel område och fiberlängd, och mitokondriell storlek och cirkularitet som ett resultat av genetiska mutationer i Nematoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Morfologiska variationer har ofta bedömts genom manuell räkning av märkbara skillnader eller genom godtyckliga tröskelvärden för att fastställa defekter jämfört med en typ av vildtyp. På senare tid har dock kvantitativa metoder använts för jämförande studier av morfologi för att noggrant mäta och beskriva förändringar på en cellulär och subcellulär nivå på ett förutsättningslös sätt. Förmågan att identifiera subtila men biologiskt relevanta skillnader mellan fenotyper är ett kraftfullt sätt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Neumann Lab för värdefulla diskussioner och synpunkter. Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH kontor forskningsinfrastruktur program (P40 OD010440). Författarna tackar WormBase för sin rikedom av information om C. elegans, och erkänna Monash Micro Imaging, Monash University, för tillhandahållande av instrumentering, utbildning och teknisk support. Detta arbete stöddes av CMTAA forskningsanslag (2015 och 2018), och NHMRC projektbidrag 1101974 och 1099690 tilldelas B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
Referências
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
