使用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

Summary

这里描述的是使用16S rRNA基因组测序和利用免费工具进行分析的微生物群分析的简化标准操作程序。该协议将帮助那些对微生物群领域较新的研究人员，以及那些需要更新方法以更高分辨率实现细菌分析的研究人员。

Abstract

人类肠道被数以万亿计的细菌殖民，这些细菌支持食物代谢、能量收集以及免疫系统调节等生理功能。健康肠道微生物群的扰动被建议在炎症性疾病（包括多发性硬化症（MS）的发展中发挥作用。环境和遗传因素会影响微生物群的组成;因此，识别与疾病表型有关的微生物群落已成为确定微生物群在健康和疾病中的作用的第一步。使用16S rRNA基因组测序来分析细菌群落有助于推进微生物群研究。尽管其用途广泛，但基于16S rRNA的分类分析没有统一的协议。另一个限制是，由于技术困难（如较小的排序读取），分类分配分辨率较低，以及由于反向 （R2） 读取质量低，在最终分析中使用仅转发 （R1） 读取。需要一种具有高分辨率的简化方法来描述给定生物标本中的细菌多样性。测序技术的进步，能够以高分辨率对较长的读取进行测序，这有助于克服其中一些挑战。目前的测序技术与公开提供的基因组分析管道相结合，如基于R的分因性安培隆去诺算法-2（DADA2）有助于推进高分辨率的微生物分析，因为DADA2可以在属中分配序列和物种水平。此处介绍的指南是使用 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域的两步扩增执行细菌分析的指南，然后使用免费提供的分析工具（即 DADA2、Phyloseq 和 METAGENassist）进行分析。相信这个简单而完整的工作流程将成为有兴趣进行微生物群落分析研究的研究人员的极佳工具。

Introduction

微生物群是指生活在特定环境中的微生物（细菌、病毒、古生物、噬菌体和真菌）的集合，微生物群是指常驻微生物的集体基因组。由于细菌是人类和小鼠中最丰富的微生物之一，本研究只侧重于细菌分析。人类肠道被数以万亿计的细菌和数以百计的^{细菌菌株1}殖民。正常的肠道微生物群通过调节功能（即维持完整的肠道屏障、食物代谢、能量平衡、抑制致病微生物的殖民化，以及调节免疫反应）^{2，3，4，5}。肠道微生物群的成分扰动与多种人类疾病有关，包括胃肠道^{疾病6、肥胖7、8、中风9、癌症10、糖尿病8，11，}类风湿性^{关节炎12，过敏13，}和中枢神经系统相关疾病，如多发性硬化症（MS）14，15和阿尔茨海默氏症疾病（AD）8，16 。因此，近年来，人们越来越关注识别不同身体部位细菌成分的工具。可靠方法应具有高通量、易用、具有高分辨率细菌微生物群分类、成本低等特点。

基于培养的微生物技术不够敏感，无法识别和描述复杂的肠道微生物群，因为几种肠道细菌未能在培养中生长。基于测序的技术的出现，特别是基于16S rRNA的基因组测序，克服了其中一些挑战，改变了微生物群学^研究17。先进的基于16S rRNA的测序技术有助于建立肠道微生物群在人类健康中的关键作用。国家卫生^{研究院的”}人类微生物群落项目”和”MetaHIT项目”（欧洲^倡议）19都有助于建立微生物群落分析的基本框架。这些举措有助于启动多项研究，以确定肠道微生物群在人类健康和疾病中的作用。

一些小组在炎症性^{疾病12、14、15、20、21、22}的患者中表现出肠道消化不良。尽管由于多路复用和低成本，广泛用于分类分析，但对于基于 16S rRNA 的分类分析，没有统一的协议。另一个限制是分类分配分辨率低，因为测序读取（150 bp 或 250 bp）较小，并且由于低质量反向排序读取 （R2） 而只使用正向排序读取 （R1）。然而，测序技术的进步帮助克服了其中一些挑战，例如使用成对端读取（例如，Illumina MiSeq 2x300bp）对较长的读取进行排序的能力。

目前的测序技术可以测序600bp高质量的读取，这允许合并R1和R2读取。这些合并的较长的 R1 和 R2 读取允许更好的分类分配，特别是使用基于开放访问的 R 的分因安培放大器算法 -2 （DADA2） 平台。DADA2利用基于放大子序列变量（ASV）的赋值，而不是基于QIIME²³所利用的97%的相似性的操作分类单元（OTU）分配。ASV 匹配导致数据库中在 1⁄2 核苷酸内的精确序列匹配，从而导致属和物种级别的分配。因此，更长、高质量的成对端读取和更好的分类分配工具（如DADA2）的组合改变了微生物学研究。

此处提供了使用 16S rRNA V3_V4 区域的两步扩增和使用 DADA2、Phyloseq 和 METAGENassist 管道进行数据分析的分步指南。在这项研究中，使用人类白细胞抗原（HLA）II类转基因小鼠，因为某些HLAII类等位基因与MS^20、24、25等自身免疫性疾病的易感性有关。然而，HLA II类基因在调节肠道微生物群的组成方面的重要性尚不清楚。据推测，HLA II 类分子会通过选择特定细菌来影响肠道微生物群落。主要组织相容性复合物 （MHC） II 类敲除小鼠 （AE.KO） 或表达人类 HLA-DQ8 分子 （HLA-DQ8） 的小鼠^24、25、26用于了解 HLA II 类分子在塑造肠道微生物群落。据信，这种基于R数据分析的完整和简化的工作流程将成为有兴趣进行微生物学分析研究的研究人员的极佳工具。

缺乏内源性小鼠MHCII类基因（AE.KO）^和AE-/-的小鼠的生成。HLA-DQA1_0103，DQB1_0302（HLA-DQ8）转基因小鼠具有C57BL/6J背景，前面已经^{描述了26。}从两性小鼠（8-12周龄）收集粪便样本。根据NIH和机构指南，小鼠以前在爱荷华大学动物设施中繁殖和维护。污染控制策略，如在层流柜内让小鼠退异，在不同菌株之间更换手套，以及适当维护小鼠，是分析肠道微生物群的关键步骤。

在整个过程中，强烈建议使用适当的个人防护设备 （PPE）。执行DNA分离、PCR1和PCR2扩增以及测序步骤时，应包括适当的阴性对照。建议使用无菌、无DNase、无RNase和无热原的用品。在整个协议中，应使用用于微生物工程的指定移液器和过滤移液器吸头。微生物群分析包括七个步骤：1）粪便样品的收集和处理;2）提取DNA;3） 16S rRNA基因扩增;4） 使用索引PCR构建DNA库;5） 索引 PCR（库）的清理和量化;6） MiSeq测序;7）数据处理和序列分析。图1显示了所有协议步骤的示意图。

Protocol

该协议得到了爱荷华大学动物护理和使用委员会的批准。 1. 粪便样品收集和处理 用70%乙醇对分压箱进行消毒（见材料表，补充图1）。 预标记微离心管（每只鼠标一个），带有样品ID和处理组（如适用）。 将小鼠放入消毒分压箱中，让它们正常排便长达 1 小时。 使用无菌钳将粪便颗粒收集到一个预先标记为 1.5 mL 的空式…

Representative Results

由于MHCII类分子（HLA在人类）是自适应免疫反应的中心参与者，并表现出与MS24，25，26的倾向性强关联， 它被假设HLA II类分子会影响肠道微生物成分。因此，缺乏MHC II类基因（AE.KO）或表达人类HLA-DQ8基因（HLA-DQ8）的小鼠被用来理解HLA II类分子在塑造肠道微生物群落中的重要性。 从AE.KO（n = 16）和HLA-DQ8（n= 1…

Discussion

所述方案很简单，具有易于遵循的步骤，使用来自大量感兴趣的生物标本的 16S rRNA 基因组测序执行微生物群分析。下一代测序已经改变了微生物生态学研究，特别是在人类和临床前疾病^{模型31，32。}该技术的主要优点是能够成功地分析复杂微生物组合物（可培养和非可培养微生物）在给定的生物标本在高通量水平和^{低成本32。}然而，几?…

Materials

1.5 ml Natural Microcentriguge Tube	USA, Scientific	1615-5500	Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G	3M, MN, US	7100038651	Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter, IN, USA	A63880	PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps	Illumina, Inc., CA, USA	15026762	New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit	MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA	12855-100	DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)	Kapa Biosystem, MA, USA	KK2602	PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes	Lewis Bins, WI, US	ND03080	Fecal collection
Magnetic stand	New England BioLabs, MA, USA	S1509S	For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA	4346906	PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA	4311971	PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge	Beckman Coulter, IN, USA	B30154	Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3	Illumina, Inc., CA, USA	MS-102-3003	For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina, Inc., CA, USA	FC-131-1001	16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays	ASI, FL,USA	RS71-1	For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	75004393	For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control	Illumina, Inc., CA, USA	FC-110-3001	For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	A29789	For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer	Omni International, GA, USA	19-001	Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	Q32854	DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture	Illumina, Inc., CA, USA	FC-130-1005	For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large)	Lewis Bins, WI, US	DV-2280	Fecal collection
Vertical Dividers (small)	Lewis Bins, WI, US	DV-1780	Fecal collection