גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים
Summary
מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.
Abstract
התגובות הסלולר גירויים חיצוניים להסתמך בכבדות על הסט של קולטנים מבוטא במשטח התא ברגע נתון. בהתאם לכך, אוכלוסיית הקולטנים המתבטאת בפני השטח מסתגלת כל הזמן ובכפוף למנגנונים נוקשים של רגולציה. הדוגמה פרדיגמטי ואחד האירועים ביותר ללמד סחר בביולוגיה היא השליטה מוסדר של הביטוי הסינפטית של קולטני גלוטמט (GluRs). GluRs לתווך את הרוב המכריע של הגירוי הנוירולוגי במערכת העצבים המרכזית ושליטה על פעילות פיזיולוגית התלויים שינויים פונקציונליים ומבניים ברמות סינפטית ועצביים (למשל, הפלסטיות הסינפטית). שינויים במספר, מיקום, והרכב תת יחידת של פני השטח הביע GluRs להשפיע עמוקות על תפקוד עצבי, למעשה, שינויים בגורמים אלה קשורים neuropathies שונים. מוצג כאן הוא שיטה ללמוד סחר GluR בנוירונים היפוקמאל ההיפוסוייםהינתק. גישה “להאכלת נוגדנים” משמשת כדי להמחיש באופן מהותי אוכלוסיות GluR המתבטאים על פני השטח והקרומים הפנימיים. על ידי תיוג קולטני פני השטח על תאים חיים ותיקון אותם בזמנים שונים כדי לאפשר קולטנים endocyציטוזה ו/או מיחזור, תהליכים אלה סחר ניתן להעריך באופן סלקטיבי למד. זהו פרוטוקול רב-תכליתי שניתן להשתמש בו בשילוב עם גישות פרמקולוגית או ביטוי יתר של קולטנים משתנים כדי לקבל מידע חשוב על גירויים ומנגנונים מולקולריים המשפיעים על סחר בסמים. באופן דומה, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד קולטנים אחרים או פני השטח הביעו חלבונים.
Introduction
תאים לנצל את התהליך הפעיל של סחר כדי לגייס חלבונים מסוימים לוקליזציה subcellular ולהפעיל רגולציה קפדנית הרקתית על הפונקציה שלהם1. תהליך זה חשוב במיוחד עבור קולטנים טרנסקרום, כמו תגובות הסלולר גירויים סביבתיים שונים להסתמך על מפלי תאיים המופעל על ידי הפעלת הקולטן. תאים מסוגלים לשנות את התגובות הללו על ידי שינוי צפיפות, לוקליזציה, והרכב יחידת של קולטנים הביע במשטח התא באמצעות הקולטן יחידת בתקנה הסחר2. החדרת קולטנים החדש מתחת לחומרים לתוך קרום הפלזמה, יחד עם אנדוקציטוזה ומיחזור של קולטנים קיימים הם דוגמאות של תהליכי סחר הקובעים את המאגר הנקי של המשטח הביע קולטנים2. מנגנונים מולקולריים רבים משתפים פעולה כדי לווסת את סחר החלבונים, כולל אינטראקציות חלבונים בחלבון ושינויים פוסט-מפלגתיים כגון זירחון, אוביקוויציה, או פלמיטלציה2.
התקנה של סחר בקולטן נדרש במיוחד תאים מקוטב מאוד עם מבנים מיוחדים מאוד. הדוגמה פרדיגמטי היא השליטה של פונקציה עצבית על ידי סחר מוסדר של קולטני גלוטמט (glurs)3,4. גלוטמט, נוירוטרנסמיטר הגירוי העיקרי, נקשר ומפעיל משטח הביע GluRs לשלוט פונקציות נוירואליות פיזיולוגית היסוד כגון המוח הנוירוטיות והפלסטיות הסינפטית. העובדה ששינוי סחר GluR נצפתה בספקטרום רחב של neuropathies, החל בהפרעות נוירותיות למחלות ניווניות, מדגיש את החשיבות של תהליך זה5. לפיכך, הבנת האירועים המולקולריים השולטים בסחר בגלואר הוא עניין בתחומים רבים של מחקר.
בפרוטוקול זה, האכלה נוגדן שיטה מבוססת משמש כדי לכמת את רמת הקרקע ביטא GluRs בנוירונים היפוקמאל העיקרי, כמו גם להעריך כיצד שינויים הפנמה ומיחזור תוצאה ביטוי נטו הנצפים השטח. השימוש פרמקולוגיה ו/או ביטוי יתר של קולטני אקסוגני מחסה מוטציות ספציפיות הופך פרוטוקול זה גישה רבת עוצמה במיוחד לחקר מנגנונים מולקולריים בבסיס הסתגלות עצבית לגירויים סביבתיים שונים. דוגמה אחרונה של כלי השירות של פרוטוקול זה היא לימוד כיצד שינויים רב-עצרת בסביבה (כגון מודלים של מחלות) משפיעים על סחר בסמים באמצעות בחינת ביטוי המשטח במודלים כאלה.
באמצעות דוגמאות ספציפיות, זה הוכיח בתחילה כיצד מניפולציה פרמקוקולוגי מחקה גירוי פיזיולוגי (ltp כימי (cltp)] מגביר את הביטוי פני השטח של GluA1 יחידת האנדוגניים של ה-אמסוגאס-סוג של glurs (ampars) 6. הסחר של הצורה המבוטאת בצורת פוספאו-מGluN2B של NMDA-סוג של GluRs (NMDARs) מנותח גם כדי להדגים כיצד פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד את הרגולציה של סחר GluR על ידי מסוים מיקוד שינויים. למרות דוגמאות ספציפיות אלה משמשים, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מוחל על GluRs אחרים וקולטנים אחרים וחלבונים בעלי תחומים מורים אנטיגניים. במקרה שאין נוגדנים זמינים עבור תחומים מגלותוניים, ביטוי יתר של אפיוליותאופ-מתויג (למשל, דגל-, Myc-, GFP-tagged, וכו ‘) חלבונים יכולים לסייע בתיוג חלבונים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק הוראות לכימות צפיפות מסוג מסוים של GluR וסחר באמצעות נוגדנים ספציפיים. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ללמוד 1) הכולל משטח GluR ביטוי, 2) הפנמה GluR, ו 3) מיחזור GluR. כדי ללמוד כל תהליך בנפרד, מומלץ להתחיל בסעיפים 1 ו-2 ולהמשיך בסעיף 3, 4 או 5. בכל המקרים, סיים עם סעיפים 6 ו-8 (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
האינטראקציה בין תא לסביבתו (למשל, תקשורת עם תאים אחרים, תגובה לגירויים שונים וכו ‘), נשענת בכבדות על ביטוי נכון של קולטנים במשטח התא. התקנה המהירה והטובה ביותר של תוכן הקולטן לפני השטח מאפשרת תגובה תאית נאותה לסביבה שמשתנה ללא הרף. במקרה מסוים של נוירונים, שינויים במספר, לוקליזציה, והרכב יחי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז הצפון מערבי למיקרוסקופיה מתקדמת לשימוש במיקרוסקופ הconfocal של ניקון A1 ובעזרתם בתכנון ובניתוח הניסויים. מחקר זה נתמך על ידי כלאמים (T32GM008061) (א. מ. ג.), ו-NIA (R00AG041225) ומענק החוקר הצעיר NARSAD מן המוח & התנהגות המחקר הקרן (24133) (א. ס.-ג.).
Materials
| 18 mm dia. #1.5 thick coverglasses | Neuvitro | GG181.5 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21424 | |
| Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21429 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary | Life Technologies | A21236 | |
| Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary | Life Technologies | A21245 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 3513 | |
| Dynasore | Tocris | 2897 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glycine | Tocris | 0219 | |
| Goat anti-rabbit Fab fragments | Sigma | SAB3700970 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Mouse anti-GluA1 antibody | Millipore | MAB2263 | |
| NaCl | Sigma | S6546 | |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | |
| NGS | Abcam | Ab7481 | |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Pelco BioWave | Ted Pella | 36500 | |
| PFA | Alfa Aesar | 43368 | |
| Picrotoxin | Tocris | 1128 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36934 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-PSD-95 antibody | Cell Signaling | 2507 | |
| Strychnine | Tocris | 2785 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| TTX | Tocris | 1078 |
Referências
- Enns, C. Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Bedford, F. K., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3385-3389 (2009).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications. The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Molnar, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
- Lu, W., et al. Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons. Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).
- Tham, D. K. L., Moukhles, H. Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient. Journal of Visualized Experiments. (91), e51896 (2014).
- Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).
- Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures. Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).
- Trussell, L. Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , (2001).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), e1067 (2009).
