自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成
Summary
本稿では、抗原特異的CD8 T細胞の生成のためのプロトコルと、インビトロおよびインビボで使用する機能性T細胞の数が多いことを目的としたインビトロでの増殖について説明する。
Abstract
1型糖尿病(T1D)は、β細胞破壊およびインスリン産生の絶対喪失につながる細胞特異的自己免疫を特徴とする。自発的非肥満糖尿病(NOD)マウスモデルでは、インスリンが主な標的であり、これらの動物の遺伝子操作により単一のキーインスリンエピトープを除去することが疾患を予防する。従って、この病原性エピトープを有する専門抗原提示細胞(APC)の選択的排除は、望ましくないインスリン特異的自己免疫応答を阻害するアプローチであり、かつより大きな翻訳可能性を有する可能性が高い。
キメラ抗原受容体(CA)は、T細胞を疾患を引き起こす抗原を選択的に標的にするようにリダイレクトすることができます。この技術は、複数の癌を治療するために養子細胞療法に細胞工学を使用する最近の試みの基礎である。このプロトコルでは、少数のナイーブ細胞から始まる機能性抗原特異的CD8 CAR-T細胞の数が多く生成される最適化されたT細胞レトロウイルス(RV)伝達およびインビトロ拡張プロトコルについて説明する。以前は複数のCAR-T細胞プロトコルが記載されていたが、典型的には、トランスダクション後のトランスダクション効率および細胞生存率が比較的低い。対照的に、当社のプロトコルは最大90%のトランスダクション効率を提供し、生成された細胞は生体内で2週間以上生存し、単回注入後の疾患発症を著しく遅らせることができます。重要な手順を簡単に実行できるように、細胞の維持および伝達プロトコルの詳細な説明を提供します。一次細胞分離からCAR式までの手順全体は、14日以内に実行できます。一般的な方法は、標的が知られている任意のマウス疾患モデルに適用されてもよい。同様に、特定の用途(病原性ペプチド/MHCクラスII複合体を標的とする)は、主要複合体が同定された他の自己免疫疾患モデルに適用可能である。
Introduction
望ましくないオフターゲット効果のリスクが減少する可能性が高いことを考えると、抗原特異的免疫療法(ASI)はT1Dなどの自己免疫疾患に対する有望な治療法です。蓄積された証拠は、(プレプロ)インスリンに対する免疫応答がT1D1において特に重要であるかもしれないことを示唆している。過去10年間、当社を含む複数のグループからの研究は、特定のMHCクラスII分子(B:9-23/MHCII)によるインスリンB鎖アミノ酸9~23を含むエピトープの提示がT1Dの開発において重要な役割を果たしていることを強く示唆している。マウスとヒト2,3,4,5.B:9-23/MHCII複合体を選択的に標的にするために、mAb287という名前のモノクローナル抗体を生成し、他のペプチド6を含むホルモンインスリンまたは複合体に対する交差反応性を有しない。MAb287はインビトロでの抗原提示をブロックし、mAb287を糖尿病前NODマウスに毎週投与すると、処置されたマウス6の35%におけるT1Dの発達を遅らせた。生体内の抗原の提示をブロックするためには、通常、高い循環濃度を維持するために頻繁な注射が必要である。我々は、T細胞を再プログラムするためにAb287の高い特異性を利用してこの困難を克服し、それによってT1D7に対する抗原特異的T細胞療法を改善できると仮定した。
細胞傷害性T細胞は、彼らの認知リガンドの単一のコピーが8、9、10を発現した場合、その標的を殺すことができると報告されている。従って、B:9-23/MHCII特異的CD8T細胞は、親抗体よりも不要な抗原提示を排除する上で高い効率を有することが期待され、その効果を発揮するために同じAPC上の複数の複合体に結合する必要が生じやすい。CAR T細胞は、複数のヒト癌11、12、13の治療に使用されており、また、自己免疫14においても有効であり続けであり、かつ有効でありうる。しかしながら、病原性ペプチド-MHC複合体に対する特異性を持つCAR-T細胞は、これまでT1Dの進行を修飾するために使用されていない。以下に説明する最適化されたCD8 T細胞伝達技術を用いて、我々は最近、これが実際に実行可能なアプローチ7を表す原理の証明を示した。
このプロトコルでは、効率的かつ合理化されたトランスダクションおよび拡張方法の概要を説明する。我々のプロトコルは、高効率のマウスCD8 CAR T細胞の生成を必要とする他の研究にも適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、レトロウイルス伝達によって抗原特異的CD8 CAR-T細胞を産生するための効率的な方法を説明する。私たちのプロトコルのトランスダクション効率は一般的に高く、CARの堅牢な発現は一般的に観察されます。拡張されたCAR T細胞は、親活性化T細胞の本質的な特徴、および抗体特異性を保持し、インビトロおよびインビボ使用の両方に適している。NODマウス7における1型糖尿病?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、JDRF助成金1-INO-2015-74-S-B、2-SRA-2016-238-S-B、SRA-2-S-2018-648-S-B、糖尿病教育・行動賞、キャロライン・ウィーズ法基金(ベイロー・カレッジ)の支援を受けています。細胞選別は、NIH(S10RR024574およびP30CA125123)からの資金でベイラー医科大学の細胞メトリーおよび細胞選別コアによってサポートされました。すべてのペプチド-MHCテトラマーは、NIHテトラマーコア施設から得られた。
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
Referências
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