Modulação da localização subcelular tau como uma ferramenta para investigar a expressão de genes relacionados à doença

Resumo

Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.

Resumo

Tau é uma proteína de ligação microtúnuo expressa nos neurônios e sua principal função conhecida está relacionada à manutenção da estabilidade citosquelética. No entanto, evidências recentes indicaram que Tau também está presente em outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo onde está implicado na proteção do DNA, na transcrição do rRNA, na mobilidade de retrotransposons e na organização estrutural do Nucléolo. Recentemente, demonstramos que tau nuclear está envolvido na expressão do gene VGluT1, sugerindo um mecanismo molecular que poderia explicar o aumento patológico da liberação de glutamato nos estágios iniciais da doença de Alzheimer. Até recentemente, o envolvimento do tau nuclear na modulação da expressão de genes-alvo tem sido relativamente incerto e ambíguo devido a limitações técnicas que impediram a exclusão da contribuição de Tau citoplasmic ou o efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau. Para superar essa incerteza, desenvolvemos um método para estudar a expressão de genes-alvo especificamente modulados pela proteína tau nuclear. Nós empregamos um protocolo que acople o uso de sinais da localização e do fration subcellular, permitindo a exclusão da interferência das moléculas citoplasmômicas de Tau. Mais notavelmente, o protocolo é fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis para estudar a função nuclear de Tau em outros tipos de células e condições celulares.

Introdução

As funções da proteína Tau no núcleo têm atraído interesse significativo nos últimos anos, uma vez que tem se mostrado intimamente associada com os ácidos nucleicos^1,2,3,4,5,6. Na verdade, um estudo recente em todo o genoma demonstrou que Tau liga seqüências de DNA genic e intergênicos in vivo⁷. Um papel na organização nucleolar foi sugerido^8,9,10,

Protocolo

1. Cultura celular

1. Células Cultura SH-SY5Y (linha de células neuroblastoma humanas, CRL-2266) em meio completo (o meio modificado eagle de Dulbecco:mistura de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina). Manter as células em uma incubadora a 37 °C e 5% CO₂. Crescer as células em placas de 10 cm e dividir quando confluent.

2. Diferenciação celular

1. Para diferenciar as células SH-SY5Y, no dia seguinte ao revestimento, adicione 10 μM ácido retinóico (AR) para completar o meio por 5 dias.
2. O sexto dia s....

Resultados

A estratégia utilizada para dissecar o impacto do tau nuclear na expressão gênica evitando a contribuição de proteínas tau citoplasmasais tem sido retratada na Figura 1. Resumidamente, as proteínas Tau marcadas com NLS ou NES são acumuladas ou excluídas do compartimento nuclear, respectivamente. O efeito funcional deste desequilíbrio é a alteração da expressão gênica medida como produto do gene VGluT1.

Discussão

Descrevemos um método para medir o impacto da proteína tau nuclear na expressão gênica. Com este protocolo, a contribuição do tau citoplasmic é fortemente limitada. Os passos críticos deste protocolo são os seguintes: a diferenciação das células neuroblastoma humana SH-SY5Y, o fracionamento subcelular e a localização da proteína Tau no compartimento nuclear.

Primeiro, como mostrado na seção de resultados representativos, a diferenciação das células SH-SY5Y, adicionando RA e BDNF é crucial para.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 633 cabra anti-rato IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti actina anticorpo	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-coelho WB 1:10.000
anti GAPDH anticorpo	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-rato WB 1:10.000
anti H2B anticorpo	Abcam	ab1790	anti-coelho WB 1:15.000
anticorpo Tau-13	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-mouse WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulina alfa Anticorpo	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-rato WB 1:5.000
anti VGluT1 Anticorpo	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-rato WB 1:500
BCA Kit de Ensaio de Proteína	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Leite em pó desnatado
BOVIN ALBUMINA SÉRICA	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	inibidor de protease
Criterion TGX 4-20% Livre de manchas, 10 poços	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Águia Modificada de DulbeccoEuroclone de Glicose Média Baixa		ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0,5 M
Soro Bovino Fetal	Euroclone	EC50182L
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Cabra anti-rato IgG-HPR	Santa Cruz Biotecnologia	sc-2005	WB 1:1.000
Cabra anti-coelho IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1,000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Lâmina de câmara 8 poços lâmina de vidro	nunc	177402
L-glutamina	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 reagente de transfecção	Thermo Fisher Scientific	12566014	lipídio catiônico
Metanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM reduziu o meio sérico	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
Solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
Inibidor	fosfatase	Roche	4906837001
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Etapa 3.10
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Kit de fracionamento de proteínas subcelulares para células cultivadas	Thermo Fisher Scientific	78840
Membrana de nitrocelulose suportada	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833.920
TCS SP2 microscópio confocal de varredura a laser	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Surfactante não iônico
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0,50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD antifade meio de montagem	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps Sistemas de Purificação	de DNAPromega	A1330	Etapa 3.5

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