Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress
Summary
Denne metode er nyttig til at kvantificere den tidlige dynamik i cellulær vedhæftning og spredning af forankring-afhængige celler på fibronectin. Desuden kan denne analyse anvendes til at undersøge virkningerne af ændret redox homeostase på celle spredning og/eller celle vedhæftning-relaterede intracellulære signalering veje.
Abstract
Adhæsion og spredning af celler til den ekstracellulære matrix (ECM) er essentielle cellulære processer under organismal udvikling og til homeostase af voksent væv. Interessant, oxidativ stress kan ændre disse processer, og dermed bidrage til Patofysiologi af sygdomme som metastatisk kræft. Derfor forståelse mekanismen (r) af, hvordan cellerne vedhæfte og sprede på ECM under forstyrrelser i redox status kan give indsigt i normale og sygdomstilstande. Beskrevet nedenfor er en Step-Wise protokol, der udnytter en immunofluorescens-baseret assay til specifikt kvantificere celle vedhæftning og spredning af udødeliggjort fibroblast celler på fibronektin (FN) in vitro. Kort, forankrings-afhængige celler holdes i suspension og udsat for ATM kinase-hæmmer Ku55933 at fremkalde oxidativt stress. Cellerne er derefter belagt på FN-belagt overflade og lov til at vedhæfte i forudbestemte perioder. De celler, der forbliver fastgjort, er faste og mærket med fluorescens baserede antistof markører for adhæsion (f. eks. paxillin) og spreder sig (f. eks. F-actin). Data opsamling og-analyse udføres ved hjælp af almindeligt tilgængeligt laboratorieudstyr, herunder et epifluorescens mikroskop og frit tilgængeligt Fiji-software. Denne procedure er meget alsidig og kan ændres for en række forskellige cellelinjer, ECM proteiner, eller hæmmere for at undersøge en bred vifte af biologiske spørgsmål.
Introduction
Celle-matrix sammenvoksninger (dvs. fokale sammenvoksninger) er store og dynamiske multimolecular protein komplekser, som mægle celle vedhæftning og spredning. Disse processer er afgørende for vævs udvikling, vedligeholdelse og fysiologiske funktion. Fokale sammenvoksninger er sammensat af membran-bundne receptorer, såsom integriner, samt stilladser proteiner, der forbinder cytoskelet actin til den ekstracellulære matrix (ECM)1. Disse komplekser er i stand til at reagere på fysisk-kemiske signaler til stede i det ekstracellulære miljø gennem aktivering af forskellige signalering transduktionsveje. Som sådan, fokale sammenvoksninger tjene som signalering centre til at udbrede ekstracellulære mekaniske signaler i en række cellulære processer, herunder instrueret migration, celle cyklus regulering, differentiering, og overlevelse1,2. En gruppe af signalering molekyler, der regulerer og interagerer med fokale sammenvoksninger omfatter medlemmer af Rho familien af små GTPases. Rho GTPases er nøgle proteiner, der regulerer celle migration og vedhæftnings dynamik gennem deres specifikke spatiotemporale aktivering3. Ikke overraskende, dysregulering af Rho protein funktion har været impliceret i en række menneskelige patologier såsom metastase, angiogenese, og andre. Af særlig interesse, cellulære redox status spiller en fremtrædende rolle i modulering af celle migration og vedhæftning. Ændringer i redox homøostase, såsom stigninger i reaktive oxygenarter (ros), er blevet påvist at regulere Rho protein aktivitet, samt vedhæftning, i en række celletyper og sygdomme hos mennesker4,5,6 ,7,8. For eksempel, personer, der lider af den neurologiske lidelse Ataxia-telangiectasia (A-T), som er forårsaget af en mutation i DNA-skade reparation Serin/threonine kinase A-T-muteret (ATM), har en øget risiko for metastatisk kræft9, 10. Tab af ATM kinaseaktivitet hos disse patienter og cellelinjer, enten gennem genetisk mutation eller kemisk hæmning, resulterer i høje niveauer af oxidativ stress på grund af dysfunktion af pentose fosfat pathway7,11, 12. Desuden har nylige undersøgelser fra laboratoriet fremhævet en patofysiologisk rolle for ROS i A-T ved at ændre cytoskelet dynamik (dvs. vedhæftning og spredning) som et direkte resultat af aktivering af Rho Family GTPases in vitro5. Isidste ende kan disse ændringer i cytoskelet dynamik forårsaget af Rho familie aktivering føre til den øgede risiko for metastatisk kræft konstateret i A-T patienter5,13. Derfor kan forståelse af samspillet mellem celle-matrix interaktioner under oxidativ stress give indsigt i reguleringen af vedhæftning og spredning. Disse undersøgelser kan også sætte scenen for yderligere undersøgelser af en mulig rolle for Rho Family GTPases i disse signalerings processer.
Beskrevet heri er en protokol til at studere den tidlige cellulære dynamik af vedhæftning samling og spredning under oxidativ stress forårsaget af hæmning af ATM kinase aktivitet. Denne analyse er baseret på den velkarakteriserede mekanisme af forankring-afhængige celler vedhæftning til ECM protein fibronektin (FN). Når celler opretholdes i suspension er belagt på FN, flere Rho gtpases koordinere kontrol af actin cytoskelet remodeling3,14. Morfologiske ændringer observeres som celler skifte fra runde og cirkulære i udseende til fladtrykt og ekspanderet. Samtidig med disse observationer er udviklingen af talrige matrix sammenvoksninger med ECM. Disse ændringer tilskrives bifasisk aktivering af rhoa med Rac1 i løbet af den første time, da cellerne klæber og spredes 15,16.
En række forskellige metoder er blevet udnyttet til at undersøge vedhæftnings morfologi og dynamik samt celle spredning. Men disse metoder er afhængige af sofistikerede langsigtede, Live-imaging samlede interne refleksion fluorescens (TIRF) eller confokale mikroskopi systemer. Således, brugere skal have adgang til specialiseret udstyr og software. Desuden gør den opsatte tid, der kræves af disse Bio-Imaging systemer, indfangning af tidlige vedhæftnings hændelser udfordrende, især ved testning af flere hæmmere eller behandlingsbetingelser samtidig.
Metoderne detaljeret, heri, giver en enkel, økonomisk, men alligevel kvantitativ måde at vurdere parametre, der regulerer vedhæftnings samlingen og sprede in vitro. Protokollen udføres ved hjælp af almindeligt tilgængelige laboratorieudstyr, såsom et epifluorescens mikroskop og CCD-kamera. Denne analyse omfatter anvendelse af forankrings afhængige celler på en FN-belagt overflade efter en periode med oxidativt stress forårsaget af kemisk hæmning af ATM kinaseaktivitet, hvilket tidligere er påvist5. Efter plating, er cellerne tilladt at vedhæfte og overholde specificerede længder af tid. Ikke-tilsluttede celler vaskes væk, mens tilknyttede celler er faste og mærket med fluorescens baserede antistoffer til markører for adhæsion (f. eks. paxillin) og breder sig (f.eks. f-actin)2,5. Disse proteiner visualiseres og registreres derefter ved hjælp af et epifluorescens mikroskop. Efterfølgende dataanalyse udføres ved hjælp af frit tilgængelige Fiji software. Desuden kan denne metode tilpasses til at undersøge vedhæftnings dynamik under en lang række betingelser, herunder forskellige ECM-proteiner, behandling med forskellige oxidanter/celle dyrkningsbetingelser eller en række forankrings afhængige cellelinjer for at løse en bred vifte af biologiske spørgsmål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet her, er en alsidig og økonomisk måde til hurtigt at screene en række forankrings afhængige celletyper til dynamisk cytoskelet remodeling under celle spredning. Især undersøger denne metode kvantitativt stress fiber og fokal vedhæftnings dannelse under oxidativ stress, når cellerne overholder FN (figur 1a). Desuden kan disse cellulære fænotyper foreslå en regulerende rolle for medlemmer af Rho familien af små gtpases, da de har dokumenteret roller un…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker DRs. Scott R. Hutton og Meghan S. Blackledge for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af High point Universitetets forskning og sponsorerede programmer (MCS) og den bioteknologiske program på North Carolina State University (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
