Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress
Summary
Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.
Abstract
De hechting en verspreiding van cellen op de extracellulaire matrix (ECM) zijn essentiële cellulaire processen tijdens de organismale ontwikkeling en voor de homeostase van volwassen weefsels. Interessant is dat oxidatieve stress deze processen kan veranderen en zo bijdraagt aan de pathofysiologie van ziekten zoals gemetastaseerde kanker. Daarom kan het begrijpen van het mechanisme (s) van hoe cellen hechten en zich verspreiden op de ECM tijdens verstoringen in redox status inzicht geven in de normale en ziektetoestanden. Hieronder beschreven is een stapsgewijs protocol dat een immunofluorescentietest gebruikt om specifiek celadhesie en verspreiding van vereeuwigd fibroblast cellen op fibronectin (FN) in vitro te kwantificeren. Kort, verankerings afhankelijke cellen worden vastgehouden in suspensie en blootgesteld aan de ATM kinase remmer Ku55933 voor het opwekken van oxidatieve stress. Cellen worden vervolgens geplateerd op een FN-gecoat oppervlak en mogen voor vooraf bepaalde perioden worden bevestigd. Cellen die bevestigd blijven, zijn vast en gelabeld met fluorescentie-antilichaam markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin). Gegevensverzameling en-analyse worden uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, waaronder een epifluorescentie Microscoop en gratis beschikbare Fiji-software. Deze procedure is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor een verscheidenheid aan cellijnen, ECM-eiwitten of remmers om een breed scala aan biologische vragen te onderzoeken.
Introduction
Celmatrix verklevingen (d.w.z. focale verklevingen) zijn grote en dynamische multimoleculaire proteïne-complexen die de hechting en verspreiding van cellen bemedieren. Deze processen zijn essentieel voor weefsel ontwikkeling, onderhoud en fysiologische functie. Focale verklevingen zijn samengesteld uit membraan-gebonden receptoren, zoals integrinen, evenals steigers eiwitten die cytoskelet actine koppelen aan de extracellulaire matrix (ECM)1. Deze complexen zijn in staat om te reageren op fysiochemische signalen die aanwezig zijn in de extracellulaire omgeving door het activeren van verschillende signalering transductie trajecten. Als zodanig, focale adhesies dienen als signalering centra te propageren extracellulaire mechanische aanwijzingen in een aantal cellulaire processen, met inbegrip van gerichte migratie, celcyclus regulering, differentiatie, en overleving1,2. Een groep van signalering moleculen die reguleren en interactie met focale adhesies omvat leden van de familie van de Rho van kleine GTPases. Rho GTPases zijn belangrijke eiwitten die de Celmigratie en adhesie dynamiek reguleren via hun specifieke spatiotemporele activatie3. Niet verrassend, disregulatie van de Rho eiwit functie is betrokken bij een aantal menselijke pathologieën zoals metastase, angiogenese, en anderen. Van bijzonder belang, cellulaire redox status speelt een overheersende rol in de modulatie van de Celmigratie en adhesie. Veranderingen in redox homeostase, zoals stijgingen van de reactieve zuurstof soorten (Ros), zijn aangetoond dat het reguleren van de Rho-eiwit activiteit, evenals adhesie, in een aantal celtypen en menselijke ziekten4,5,6 ,7,8. Bijvoorbeeld, personen die lijden aan de neurologische aandoening ataxie-Telangiectasia (A-T), die wordt veroorzaakt door een mutatie in de DNA-schade herstel serine/Threonine kinase A-T-gemuleerd (ATM), hebben een verhoogd risico op gemetastaseerde kanker9, 10. Verlies van ATM kinase activiteit bij deze patiënten en cellijnen, hetzij door genetische mutatie of chemische remming, resulteert in hoge niveaus van oxidatieve stress als gevolg van disfunctie van de pentose fosfaat pathway7,11, 12. Bovendien hebben recente studies van het laboratorium een pathofysiologische rol voor ROS in A-T belicht door de cytoskelet dynamiek (d.w.z. adhesie en verspreiding) te veranderen als een direct gevolg van het activeren van de Rho familie GTPases in vitro5. Uiteindelijkkunnen deze veranderingen in de cytoskelet dynamiek veroorzaakt door de activering van de familie Rho leiden tot het verhoogde risico van gemetastaseerde kanker bij A-T patiënten5,13. Daarom kan het begrijpen van het samenspel tussen celmatrix interacties tijdens oxidatieve stress inzicht geven in de regulering van adhesie en verspreiding. Deze studies kunnen ook het podium voor verdere onderzoeken naar een mogelijke rol voor Rho familie GTPases in deze signalering processen.
Hierin beschreven is een protocol voor het bestuderen van de vroege cellulaire dynamiek van adhesie assemblage en verspreiding tijdens oxidatieve stress veroorzaakt door remming van ATM kinase activiteit. Deze test is gebaseerd op het goed gekarakteriseerde mechanisme van verankerings afhankelijke cellen adhesie aan het ECM-eiwit fibronectine (FN). Wanneer cellen in suspensie worden geplateerd op FN, coördineren verschillende Rho gtpases de controle van de actine cytoskelet remodellering3,14. Morfologische veranderingen worden waargenomen als cellen verschuiven van ronde en cirkelvormig in uiterlijk tot afgevlakt en uitgevouwen. Gelijktijdig met deze waarnemingen is de ontwikkeling van talrijke matrix verklevingen met de ECM. Deze veranderingen worden toegeschreven aan de bifasische activering van rhoa met Rac1 tijdens het eerste uur als cellen zich hechten en verspreiden 15,16.
Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt voor het onderzoeken van adhesie morfologie en dynamiek, alsmede de verspreiding van cellen. Deze methoden zijn echter gebaseerd op geavanceerde, op lange termijn, Live-Imaging totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie systemen. Gebruikers moeten dus toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur en software. Bovendien maakt de set-up tijd die nodig is voor deze bio-imagingsystemen het vastleggen van vroege adhesie gebeurtenissen uitdagend, vooral bij het testen van meerdere remmers of behandelings condities gelijktijdig.
De hier beschreven methoden bieden een eenvoudige, economische en toch kwantitatieve manier om parameters te beoordelen die de adhesie-assemblage beheersen en in vitro verspreiden. Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, zoals een epifluorescentie-Microscoop en een CCD-camera. Deze bepaling omvat het toepassen van verankerings afhankelijke cellen op een oppervlak met FN-coating na een periode van oxidatieve stress veroorzaakt door chemische remming van ATM kinase activiteit, die eerder is aangetoond5. Na het bekleden zijn cellen toegestaan om te hechten en zich te hechten voor gespecificeerde lengtes van tijd. Niet-bevestigde cellen worden weggespoeld, terwijl de bijgevoegde cellen zijn bevestigd en geëtiketteerd met fluorescentie-antilichamen tegen markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin)2,5. Deze eiwitten worden vervolgens gevisualiseerd en opgenomen met behulp van een epifluorescentie Microscoop. Daaropvolgende data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van gratis beschikbare Fiji-software. Bovendien kan deze methode worden aangepast om de adhesie dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken, waaronder verschillende ECM-eiwitten, behandeling met verschillende oxidanten/celkweek omstandigheden of een verscheidenheid aan verankerings afhankelijke cellijnen om een breed scala aan biologische vragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol is een veelzijdige en voordelige manier om snel een aantal verankerings afhankelijke celtypen te schermen voor dynamische cytoskelet-remodellering tijdens het verspreiden van cellen. In het bijzonder onderzoekt deze methode kwantitatief stress vezels en focale adhesie vorming tijdens oxidatieve stress wanneer cellen zich houden aan FN (Figuur 1a). Bovendien kunnen deze cellulaire fenotypes een regelgevende rol suggereren voor leden van de familie Rho van kleine g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken drs. Scott R. Hutton en Meghan S. Blackledge voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de High Point University Research en gesponsorde programma’s (MCS) en het biotechnologie programma aan de North Carolina State University (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
