Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses
Summary
Diese Methode ist nützlich, um die frühe Dynamik der zellulären Adhäsion und die Ausbreitung von verankerungsabhängigen Zellen auf das Fibronectin zu quantifizieren. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Redoxhomöostase auf die Zellausbreitung und/oder zellspezifische intrazelluläre Signalwege zu untersuchen.
Abstract
Die Adhäsion und Ausbreitung von Zellen auf die extrazelluläre Matrix (ECM) sind wesentliche zelluläre Prozesse während der Entwicklung des Organismus und für die Homöostase von erwachsenen Geweben. Interessanterweise kann oxidativer Stress diese Prozesse verändern und so zur Pathophysiologie von Krankheiten wie metastasierendem Krebs beitragen. Daher kann das Verständnis der Mechanismen, wie Zellen sich während Störungen im Redoxstatus an das ECM anheften und verbreiten, einen Einblick in Normal- und Krankheitszustände geben. Im Folgenden beschrieben ist ein stufenweisen Protokoll, das einen immunfluoreszenzbasierten Assay nutzt, um die Zelladhäsion und die Verbreitung von verewigten Fibroblastenzellen auf Fibronectin (FN) in vitro gezielt zu quantifizieren. Kurz gesagt, verankerungsabhängige Zellen werden in Suspension gehalten und dem ATM-Kinase-Inhibitor Ku55933 ausgesetzt, um oxidativen Stress zu induzieren. Die Zellen werden dann auf FN-beschichtete Oberfläche plattiert und dürfen für vorgegebene Zeiträume befestigt werden. Zellen, die noch angebracht sind, sind fixiert und mit fluoreszenzbasierten Antikörpermarkern der Adhäsion (z. B. Paxillin) und der Ausbreitung (z. B. F-Actin) gekennzeichnet. Die Datenerfassung und -analyse erfolgt mit allgemein verfügbaren Laborgeräten, einschließlich eines Epifluoreszenzmikroskops und einer frei verfügbaren Fidschi-Software. Dieses Verfahren ist sehr vielseitig und kann für eine Vielzahl von Zelllinien, ECM-Proteinen oder Inhibitoren modifiziert werden, um ein breites Spektrum biologischer Fragen zu untersuchen.
Introduction
Zellmatrix-Adhäsionen (d.h. fokale Verklebungen) sind große und dynamische multimolekulare Proteinkomplexe, die zelladisieren und sich ausbreiten. Diese Prozesse sind entscheidend für die Gewebeentwicklung, Wartung und physiologische Funktion. Fokale Adhäsionen bestehen aus membrangebundenen Rezeptoren, wie Integrinen, sowie Gerüstproteinen, die Cytoskelett-Aktin mit der extrazellulären Matrix (ECM)1verbinden. Diese Komplexe sind in der Lage, auf physiochemische Hinweise in der extrazellulären Umgebung durch die Aktivierung verschiedener Signaltransduktionswege zu reagieren. Als solche dienen fokale Verklebungen als Signalzentren, um extrazelluläre mechanische Hinweise in eine Reihe von zellulären Prozessen zu verbreiten, einschließlich gerichteter Migration, Zellzyklusregulation, Differenzierung und Überleben1,2. Eine Gruppe von Signalmolekülen, die regulieren und mit fokalen Adhäsionen interagieren gehören Mitglieder der Rho-Familie von kleinen GTPases. Rho GTPases sind Schlüsselproteine, die die Zellmigration und Haftdynamik durch ihre spezifische raumzeitliche Aktivierung regulieren3. Es überrascht nicht, dass die Dysregulation der Rho-Proteinfunktion in eine Reihe von menschlichen Pathologien wie Metastasierung, Angiogenese und andere involviert ist. Von besonderem Interesse, zelluläre Redox-Status spielt eine vorherrschende Rolle bei der Modulation der Zellmigration und Adhäsion. Veränderungen in der Redoxhomöostase, wie z. B. die Zunahme der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), wurden nachgewiesen, um die Rho-Proteinaktivität sowie die Adhäsion bei einer Reihe von Zelltypen und menschlichen Krankheiten zu regulieren4,5,6 ,7,8. Zum Beispiel haben Personen, die an der neurologischen Erkrankung Ataxia-Teangiektasien (A-T) leiden, die durch eine Mutation in der DNA-Schädigung verursacht wird, eine Serin-/Threoninkinase A-T-mutiert (ATM), ein erhöhtes Risiko für metastasierenden Krebs9, 10. Der Verlust der ATM-Kinase-Aktivität bei diesen Patienten und Zelllinien, entweder durch genetische Mutation oder chemische Hemmung, führt zu einem hohen Gehalt an oxidativem Stress aufgrund einer Dysfunktion des Pentosephosphatwegs7,11, 12. Darüber hinaus haben neuere Studien aus dem Labor eine pathophysiologische Rolle für ROS in A-T hervorgehoben, indem die Zytoskelettdynamik (d. h. Haftung und Ausbreitung) als direktes Ergebnis der Aktivierung von GTPases der Rho-Familie in vitro5verändertwurde. Letztlich können diese Veränderungen in der zytoskelettalen Dynamik, die durch die Aktivierung der Rho-Familie verursacht werden, zu dem erhöhten Risiko für metastasierenden Krebs führen, das bei A-T-Patienten5,13festgestellt wird. Daher kann das Verständnis des Zusammenspiels zwischen Zell-Matrix-Wechselwirkungen während oxidativen Stresses Einblicke in die Regulation von Haftung und Ausbreitung liefern. Diese Studien können auch die Voraussetzungen für weitere Untersuchungen über eine mögliche Rolle der Rho-Familie GTPases in diesen Signalprozessen bereiten.
Beschrieben hierin ist ein Protokoll, um die frühe zelluläre Dynamik der Adhäsionsmontage zu studieren und sich während oxidativen Stresses zu verbreiten, der durch hemmung der ATM-Kinase-Aktivität verursacht wird. Dieser Test basiert auf dem gut charakterisierten Mechanismus der verankerungsabhängigen Zellen, der an dem ECM-Protein Fibronectin (FN) adhäsioniert ist. Wenn Zellen, die in Suspension gehalten werden, auf FN plattiert werden, koordinieren mehrere Rho GTPases die Steuerung des Aktin-Zytoskelett-Remodells3,14. Morphologische Veränderungen werden beobachtet, wenn sich Zellen von rundem und kreisförmigem Aussehen zu abgeflachten und erweiterten Veränderungen verschieben. Gleichzeitig mit diesen Beobachtungen ist die Entwicklung zahlreicher Matrixverklebungen mit dem ECM. Diese Veränderungen werden der biphasischen Aktivierung von RhoA mit Rac1 während der ersten Stunde zugeschrieben, da Zellen 15,16haften und verbreiten.
Eine Vielzahl von Methoden wurden verwendet, um Adhäsionmorphologie und Dynamik sowie Zellausbreitung zu untersuchen. Diese Methoden stützen sich jedoch auf ausgeklügelte langfristige, live-imaging totale interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) oder konfokale Mikroskopiesysteme. Daher müssen Benutzer Zugang zu spezialisierter Ausrüstung und Software haben. Darüber hinaus macht die für diese Bio-Imaging-Systeme erforderliche Einrichtungszeit die Erfassung früher Haftungsereignisse schwierig, insbesondere bei der gleichzeitigen Prüfung mehrerer Inhibitoren oder Behandlungsbedingungen.
Die hierin beschriebenen Methoden bieten eine einfache, wirtschaftliche und dennoch quantitative Möglichkeit, Parameter zu bewerten, die die Haftungsmontage und -verteilung in vitro steuern. Das Protokoll wird mit allgemein verfügbaren Laborgeräten wie einem Epifluoreszenzmikroskop und einer CCD-Kamera durchgeführt. Dieser Test beinhaltet die Anwendung von verankerungsabhängigen Zellen auf eine FN-beschichtete Oberfläche nach einer Periode oxidativer Belastung, die durch chemische Hemmung der ATM-Kinase-Aktivität verursacht wurde, die zuvor5nachgewiesen wurde. Nach der Beschichtung dürfen Zellen für bestimmte Zeiträume anhaften und haften. Nicht angeschlossene Zellen werden weggespült, während angehängte Zellen fixiert und mit fluoreszenzbasierten Antikörpern gegen Haftungsmarker (z. B. Paxillin) und Ausbreitung (z. B. F-Actin)2,5gekennzeichnet sind. Diese Proteine werden dann mit einem Epifluoreszenzmikroskop visualisiert und aufgezeichnet. Die anschließende Datenanalyse erfolgt mit frei verfügbarer Fidschi-Software. Darüber hinaus kann diese Methode angepasst werden, um die Haftdynamik unter einer Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen, einschließlich verschiedener ECM-Proteine, der Behandlung mit verschiedenen Oxidationsmitteln/Zellkulturbedingungen oder einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zelllinien, um eine breite Palette von biologische Fragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ist eine vielseitige und wirtschaftliche Möglichkeit, eine Reihe von verankerungsabhängigen Zelltypen für die dynamische Zytoskelett-Remodellierung während der Zellstreuung schnell abzuschirmen. Insbesondere untersucht diese Methode quantitativ die Bildung von Spannungsfasern und fokalen Adhäsionwährend während des oxidativen Stresses, wenn Zellen an FN haften (Abbildung 1A). Darüber hinaus können diese zellulären Phänotypen eine regulatorische Roll…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Drs. Scott R. Hutton und Meghan S. Blackledge für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von den Forschungs- und Förderprogrammen der High Point University (MCS) und dem Biotechnology Program der North Carolina State University (MCS) finanziert.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
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