בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני
Summary
שיטה זו שימושית לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הדבקה תאית והפצת תאים התלויים באנקורג ‘ בתוך הפיברוטין. יתר על כן, שינוי זה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעות של שינוי הומאוסטזיס מחדש על התפשטות התא ו/או הדבקה תא הקשורות מסלולים תאיים איתות.
Abstract
הדבקה והפצת תאים על מטריצת החילוץ (ECM) הם תהליכים סלולאריים חיוניים במהלך התפתחות ארגונית והומאוסטזיס של רקמות למבוגרים. מעניין, לחץ חמצוני יכול לשנות תהליכים אלה, ובכך לתרום פתופסיולוגיה של מחלות כגון סרטן גרורתי. לכן, הבנת המנגנון (ים) של כיצד תאים מתחברים ומתפשטים על ECM במהלך רטבאליות במצב מחדש יכול לספק תובנה לתוך מצבים נורמליים ומחלות. המתואר להלן פרוטוקול צעד נבון אשר מנצל באופן מבוסס immunofluorescence המבוססת במיוחד לכמת הדבקה תא והפצת התאים המוחיים פיברובטין על fibronectin (FN) ב מבחנה. בקצרה, התאים התלויים באנקורג ‘ מוחזקים בהשעיה וחשופים ל כספומט קינאז מעכבי Ku55933 כדי לגרום ללחץ חמצוני. התאים מצופים לאחר מכן במשטח מצופה FN ומורשים לצרף לפרקי זמן קבועים מראש. תאים שנשארים מחוברים הם קבועים ומסומנים עם סמני נוגדנים מבוססי-פלואורסצנטית של הדבקה (למשל, פקעבלין) ומריחה (למשל, F-actin). רכישת נתונים וניתוח מתבצעים באמצעות ציוד מעבדה זמין בדרך כלל, כולל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית וזמין באופן חופשי תוכנת פיג’י. הליך זה הוא רב-תכליתי מאוד וניתן לשנותה למגוון קווי תאים, חלבונים מסוג ECM או מעכבי כדי לבחון מגוון רחב של שאלות ביולוגיות.
Introduction
הידקויות תא מטריצות (כלומר, הידקויות מוקד) הן מכלולי חלבון רב ודינאמיים מרובי-מולקולרית, אשר מתווכים בין הדבקה והפצת תאים. תהליכים אלה קריטיים לפיתוח רקמות, תחזוקה ותפקוד פיזיולוגי. הידקויות מיקוד מורכבים קולטנים מאוגדים ממברנה, כגון אינטנס, כמו גם הפיגומים חלבונים המקשרים אקטין השלד בתוך מטריצה החילוץ (ecm)1. מתחמי אלה מסוגלים להגיב לרמזים פיזיוכימיים נוכח בסביבה המומנת באמצעות הפעלה של שבילים איתות שונים התמרה. ככזה, הידקויות מיקוד לשמש מרכזי איתות כדי להפיץ רמזים מכניים לתוך מספר תהליכים סלולריים כולל הגירה מכוונת, רגולציה מחזור התא, בידול, והישרדות1,2. קבוצה אחת של מולקולות איתות המווסת ומאינטראקציה עם הידקויות מוקד כוללות חברים של משפחת Rho של GTPases קטנים. Rho GTPases הם חלבונים מרכזיים המסדירים את הגירה התא ואת הדינמיקה הדבקה דרך ההפעלה הטמפורלית הספציפית שלהם3. לא באופן מפתיע, דיסתקנה של תפקוד החלבון של רו היתה מעורב במספר הפתווגיות אנושיות כגון גרורות, אנגיוגנזה, ועוד. מעניין מיוחד, מעמד הסלולר התאי משחק תפקיד דומיננטי באפנון של הגירה תא והדבקה. שינויים ב הומאוסטזיס, כגון הגדלת מינים חמצן תגובתי (ROS), הוכחו להסדיר פעילות חלבון Rho, כמו גם הדבקה, במספר סוגי תאים ומחלות אדם4,5,6 ,7,8. לדוגמה, אנשים הסובלים הפרעת נוירולוגיות אטקסיה telangiectasia (A-T), אשר נגרמת על ידי מוטציה בתיקון הנזק DNA סרין/טראונין קינאז A-T-מוטציה (ATM), יש סיכון מוגבר של סרטן גרורתי9, . בסדר, עשר הפסד של פעילות ATM קינאז בחולים אלה קווי תאים, או באמצעות מוטציה גנטית או עיכוב כימי, תוצאות רמות גבוהות של מתח חמצוני עקב חוסר תפקוד של מסלול פוספטפנז 7,11, . שתיים עשרה יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מן המעבדה הדגישו תפקיד פתופסולוגי עבור ROS ב-T על ידי שינוי דינמיקה השלד הציטומי (כלומר הדבקה והתפשטות) כתוצאה ישירה של הפעלת GTPases משפחת רו ב מבחנה5. בסופו של דבר, שינויים אלה הדינמיקה השלד ציטומי נגרמת על ידי הפעלת משפחת Rho עלול להוביל לסיכון מוגבר של סרטן גרורתי ציין בחולים5,13. לכן, הבנת הגומלין בין אינטראקציות תא מטריקס במהלך לחץ חמצוני יכולה לספק תובנות לגבי התקנה של הדבקה והתפשטות. מחקרים אלה יכולים גם להגדיר את הבמה לחקירה נוספת לתפקיד אפשרי עבור משפחת Rho GTPases בתהליכים אלה איתות.
מתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את הדינמיקה התאית המוקדמת של הרכבה הדבקה והתפשטות במהלך לחץ חמצוני הנגרמת על ידי עיכוב של פעילות ATM קינאז. שיטת הפעולה מבוססת על המנגנון המאופיין היטב של תאים התלויים באנקורג ‘ לחלבון ה-ecbronectin (FN). כאשר התאים הנשמרים ההשעיה מצופים FN, מספר רו gtpases לתאם את השליטה של שיפוץ אקטין השלד שיפוצים3,14. שינויים מורפולוגיים נצפו כאשר התאים משתנים מעגול ועגול במראה לשיטוח ולהרחבה. במקביל עם תצפיות אלה הוא התפתחות של הידקויות רבות של מטריקס עם ECM. שינויים אלה מיוחסים להפעלת biphasic של rhoa עם Rac1 בשעה הראשונה כמו תאים לדבוק ולהתפשט 15,16.
נעשה שימוש במגוון שיטות לבדיקת מורפולוגיה ודינמיקה של התאים והתפשטות התא. עם זאת, שיטות אלה מסתמכות על השתקפות מתוחכמת ארוכת טווח לאורך זמן, הדמיה פנימית (TIRF) או מערכות המיקרוסקופיה. לפיכך, על המשתמשים להיות בעלי גישה לציוד ולתוכנה מיוחדים. יתר על כן, זמן הגדרת הנדרש על ידי אלה הדמיה מערכות ביולוגי עושה לכידת אירועים הדבקה מוקדם מאתגרת, במיוחד בעת בדיקת מעכבי מרובים או תנאי טיפול במקביל.
השיטות המפורטות, להלן, מספקות דרך ישירה, חסכונית, אך כמותית, להעריך את הפרמטרים השולטים בהרכבת הדבקה ובהפצת מבחנה. הפרוטוקול מבוצע באמצעות ציוד מעבדה זמין בדרך כלל, כגון מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצלמת CCD. שיטת הפעולה כרוכה בהחלת תאים התלויים באנקורג ‘ למשטח FN-מצופה לאחר תקופה של מתח חמצוני הנגרם על ידי עיכוב כימי של פעילות ATM קינאז, אשר הפגינו בעבר5. לאחר הציפוי, תאים מורשים לצרף ולדבוק לאורך הזמן שצוין. תאים שאינם מצורפים נשטפים, בעוד התאים המחוברים הם קבועים ומסומנים עם נוגדנים מבוססי פלואורסצנטית סמנים של הדבקה (למשל, פקעבלין) ומתפשטת (למשל, F-actin)2,5. חלבונים אלה הם דמיינו ונרשמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי. ניתוח הנתונים הבאים מבוצע באמצעות תוכנת פיג’י זמינה בחופשיות. כמו-כן, ניתן להתאים שיטה זו לבדיקת דינמיקת הדבקה תחת מגוון רחב של תנאים, לרבות חלבונים מסוג ECM שונים, טיפול במספר רב של מצבים של חמצון/התרבות התאית או מגוון קווים תלויי-עגינה הקשורים למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא דרך מגוונת וחסכונית למסך במהירות מספר סוגי תאים תלויי האנקורג ‘ עבור שיפוץ השלד הדינאמי במהלך התפשטות התא. בפרט, שיטה זו בוחנת בוחן את סיבי הסטרס ואת היווצרות הדבקה מוקד במהלך הלחץ חמצוני כאשר התאים לדבוק FN (איור 1A). יתר על כן, אלה פנוטיפים סלולריים ע…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר סקוט ר. האטון ומייגן ס. בלקאדן לסקירה הקריטית של כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי מחקר של אוניברסיטת High Point ותוכניות ממומנים (MCS) ותוכנית ביוטכנולוגיה באוניברסיטת צפון קרוליינה סטייט (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
