Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress
Summary
Denne metoden er nyttig for kvantifisere tidlig dynamikk av cellulær vedheft og spredning av forankring-avhengige celler på fibronektin. Videre kan denne analysen brukes til å undersøke virkningene av endrede Redox homeostase på celle spredning og/eller celle vedheft-relaterte intracellulære signalering trasé.
Abstract
Vedheft og spredning av celler på ekstracellulære matrise (ECM) er essensielle cellulære prosesser under organismal utvikling og for homeostase av voksen vev. Interessant, kan oksidativt stress endre disse prosessene, og dermed bidra til patofysiologi av sykdommer som metastatisk kreft. Derfor forstå mekanismen (e) av hvordan cellene feste og spre på ECM under forstyrrelser i Redox status kan gi innsikt i normal og sykdom tilstander. Beskrevet nedenfor er en trinn-klok protokoll som utnytter en immunofluorescence-basert analysen til spesifikt kvantifisere celle vedheft og spredning av udødeliggjort Fibroblast celler på fibronektin (FN) in vitro. Kort, er anker avhengige celler holdt i suspensjon og eksponert for ATM kinase inhibitor Ku55933 å indusere oksidativt stress. Celler blir deretter belagt på FN-belagt overflate og lov til å feste for forhåndsbestemte perioder av gangen. Celler som forblir vedlagt, er faste og merket med fluorescens antistoff markører for vedheft (f.eks. paxillin) og spredning (F-utgangen). Data innsamling og analyse utføres ved hjelp av allment tilgjengelig laboratorieutstyr, inkludert et epifluorescence mikroskop og fritt tilgjengelig Fiji-programvare. Denne prosedyren er svært allsidig og kan endres for en rekke cellelinjer, ECM proteiner, eller hemmere for å undersøke et bredt spekter av biologiske spørsmål.
Introduction
Cell-Matrix adhesjon (dvs. fokal adhesjon) er store og dynamiske multimolecular protein komplekser som megle celle vedheft og spredning. Disse prosessene er avgjørende for vevs utvikling, vedlikehold og fysiologisk funksjon. Fokal adhesjon er sammensatt av membran-bundet reseptorer, slik som integrins, samt stillas proteiner som knytter cytoskjelettkomponenter utgangen til ekstracellulære matrise (ECM)1. Disse komplekser er i stand til å reagere på fysiokjemiske stikkordene til stede i ekstracellulære miljøet gjennom aktivering av ulike signalering Transduction trasé. Som sådan, fokal adhesjon tjene som signalering sentre å spre ekstracellulære mekaniske stikkordene inn i en rekke cellulære prosesser inkludert styrt migrasjon, celle syklus regulering, differensiering, og overlevelse1,2. En gruppe av signalering molekyler som regulerer og samhandler med fokal adhesjon inkluderer medlemmer av Rho familien av små GTPases. Rho GTPases er viktige proteiner som regulerer celle migrasjon og vedheft dynamikk gjennom deres spesifikke spatiotemporal aktivering3. Ikke overraskende har feilregulering av Rho protein funksjon vært innblandet i en rekke menneskelige patologi som metastasering, angiogenese og andre. Av spesiell interesse, spiller mobilnettet Redox status en dominerende rolle i modulering av celle migrasjon og vedheft. Endringer i Redox homeostase, slik som økninger i reaktive oksygen arter (ros), har vist å regulere Rho protein aktivitet, samt vedheft, i en rekke celletyper og menneskelige sykdommer4,5,6 ,7,8. For eksempel, personer som lider av nevrologisk lidelse ataksi-telangiectasia (A-T), som er forårsaket av en mutasjon i DNA skade reparasjon Serine/threonin kinase A-T-mutert (ATM), har en økt risiko for metastatisk kreft9, 10i. Tap av ATM kinase aktivitet hos disse pasientene og cellelinjer, enten gjennom genetisk mutasjon eller kjemisk hemming, resulterer i høye nivåer av oksidativt stress på grunn av dysfunksjon av pentose fosfat sti7,11, det er 12. Videre har nyere studier fra laboratoriet fremhevet en patofysiologiske rolle for ROS i A-T ved å endre cytoskjelettkomponenter dynamikk (dvs. vedheft og spredning) som et direkte resultat av aktivering av Rho-familien GTPases in vitro5. Til syvendeog sist, disse endringene i cytoskjelettkomponenter dynamikk forårsaket av Rho familie aktivering kan føre til økt risiko for metastatisk kreft bemerket i A-T pasienter5,13. Derfor kan det å forstå samspillet mellom celle-matrise interaksjoner under oksidativt stress gi innsikt i regulering av vedheft og spredning. Disse studiene kan også sette scenen for videre undersøkelser i en mulig rolle for Rho familien GTPases i disse signalering prosesser.
Beskrevet her er en protokoll for å studere tidlig Cellular dynamikk av vedheft montering og spredning under oksidativt stress forårsaket av hemming av ATM kinase aktivitet. Denne analysen er basert på den godt preget mekanisme av forankring-avhengige celler vedheft til ECM protein fibronektin (FN). Når cellene opprettholdt i suspensjon er belagt på FN, flere Rho GTPases koordinere kontroll av utgangen cytoskjelettkomponenter remodeling3,14. Morfologiske endringer er observert som celler Skift fra runde og sirkulære i utseende til flatet og utvides. Samtidig med disse observasjonene er utviklingen av en rekke Matrix adhesjon med ECM. Disse endringene tilskrives bifasisk aktivering av RhoA med Rac1 i løpet av den første timen når cellene overholder og sprer 15,16.
En rekke metoder har blitt benyttet for å undersøke vedheft morfologi og dynamikk, samt celle spredning. Men disse metodene er avhengige av sofistikerte langsiktige, Live-Imaging totale interne refleksjon fluorescens (TIRF) eller konfokalmikroskopi mikroskopi systemer. Dermed må brukerne ha tilgang til spesialisert utstyr og programvare. Videre er den innstilte tiden som kreves av disse bio-Imaging systemer gjør fange tidlig vedheft hendelser utfordrende, spesielt når du tester flere hemmere eller behandling forhold samtidig.
Metodene detaljert, her, gir en grei, økonomisk, men likevel kvantitativ måte å vurdere parametre som regulerer vedheft forsamlingen og sprer in vitro. Protokollen utføres ved hjelp av allment tilgjengelig laboratorieutstyr, for eksempel et epifluorescence mikroskop og CCD-kamera. Denne analysen innebærer å anvende anker avhengige celler til en FN-belagt overflate etter en periode med oksidativt stress forårsaket av kjemisk hemming av ATM kinase aktivitet, som har blitt demonstrert tidligere5. Etter plating, har celler lov til å feste og overholde for spesifiserte lengder tid. Ledige celler vaskes bort, mens vedlagte celler er faste og merket med fluorescens-baserte antistoffer mot markører for vedheft (f. eks paxillin) og sprer seg (f. eksutgangen)2,5. Disse proteinene er så visualisere og tatt opp ved hjelp av et epifluorescence mikroskop. Påfølgende dataanalyse utføres ved hjelp av fritt tilgjengelig Fiji-programvare. Videre kan denne metoden tilpasses for å undersøke vedheft dynamikk under et bredt spekter av forhold, inkludert ulike ECM-proteiner, behandling med ulike oksidanter/cellekultur forhold eller en rekke forankring-avhengige cellelinjer for å løse et bredt spekter av biologiske spørsmål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her er en allsidig og økonomisk måte å raskt skjermen en rekke forankring-avhengige celletyper for dynamisk cytoskeleton remodeling under celle spredning. Spesielt undersøker denne metoden kvantitativt stress fiber og fokal vedheft dannelse under oksidativt stress når cellene holder seg til FN (figur 1a). Videre kan disse cellulære fenotyper foreslå en regulerende rolle for medlemmer av Rho-familien av små GTPases siden de har dokumentert roller under celle v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker DRS. Scott R. Hutton og Meghan S. Blackledge for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av high point University ‘ s Research and sponsede programmer (MCS) og bioteknologi program ved North Carolina State University (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
