Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress
Summary
Denna metod är användbar för att kvantifiera den tidiga dynamiken i cellulär vidhäftning och spridning av förankrings beroende celler på fibronectin. Vidare, denna analys kan användas för att undersöka effekterna av förändrade redox homeostas på cell spridning och/eller cell adhesion-relaterade intracellulära signalering vägar.
Abstract
Vidhäftning och spridning av celler på den extracellulära matrisen (ECM) är viktiga cellulära processer under organismers utveckling och för homeostas av vuxna vävnader. Intressant, oxidativ stress kan förändra dessa processer, vilket bidrar till patofysiologin av sjukdomar som metastaserande cancer. Därför förstå mekanismen (er) av hur celler fäster och sprids på ECM under störningar i redox status kan ge insikt i normala och sjukdomstillstånd. Beskrivs nedan är ett stegvist protokoll som utnyttjar en immunofluorescensbaserad analys för att specifikt kvantifiera cellernas vidhäftning och spridning av förevigade fibroblastceller på Fibronektin (FN) in vitro-. Kortfattat, Anchorage-beroende celler hålls i suspension och utsätts för ATM kinashämmare Ku55933 att inducera oxidativ stress. Cellerna är sedan pläterade på FN-belagda ytan och får fästa för förutbestämda tidsperioder. Celler som förblir fästa är fasta och märkta med fluorescensbaserade antikropps markörer för vidhäftning (t. ex. paxillin) och spridning (t. ex., F-Actin). Data insamling och analys utförs med hjälp av allmänt tillgänglig laboratorieutrustning, inklusive ett epifluorescensmikroskop och fritt tillgänglig Fiji-programvara. Detta förfarande är mycket mångsidig och kan ändras för en mängd olika cellinjer, ECM proteiner, eller inhibitorer för att undersöka ett brett spektrum av biologiska frågor.
Introduction
Cell-Matrix adhesioner (dvs. fokala sammanväxningar) är stora och dynamiska multimolekyl ära proteinkomplex som förmedlar cellernas vidhäftning och spridning. Dessa processer är avgörande för vävnads utveckling, underhåll, och fysiologiska funktion. Focal sammanväxningar består av membran-bundna receptorer, såsom integriner, samt byggnadsställningar proteiner som länkar cytoskeletala aktin till extracellulära matrix (ECM)1. Dessa komplex är kapabla att reagera på fysiokemiska ledtrådar som finns i den extracellulära miljön genom aktivering av olika signaltransduktionvägar. Som sådan, Focal sammanväxningar fungera som signalering centra för att propagera extracellulära mekaniska ledtrådar i ett antal cellulära processer inklusive riktad migration, Cellcykelreglering, differentiering, och överlevnad1,2. En grupp av signalmolekyler som reglerar och interagerar med fokala sammanväxningar inkluderar medlemmar i Rho-familjen av små GTPases. Rho GTPases är viktiga proteiner som reglerar cell migration och vidhäftnings dynamik genom deras specifika spatiotemporal aktivering3. Inte överraskande, dysreglering av Rho proteinfunktion har varit inblandad i ett antal mänskliga patologier såsom metastaser, angiogenes, och andra. Av särskilt intresse, cellulära redox status spelar en dominerande roll i modulering av cell migration och vidhäftning. Förändringar i redox homeostas, såsom ökningar av reaktiva syreradikaler (ros), har visat sig reglera Rho protein aktivitet, samt vidhäftning, i ett antal celltyper och mänskliga sjukdomar4,5,6 ,7,8. Till exempel, individer som lider av den neurologiska sjukdomen ataxi-telangiectasia (A-T), som orsakas av en mutation i DNA-skadan reparation serin/Threonine Kinas A-T-muterade (ATM), har en ökad risk för metastaserad cancer9, 10. Förlust av ATM Kinas aktivitet hos dessa patienter och cellinjer, antingen genom genetisk mutation eller kemisk hämning, resulterar i höga nivåer av oxidativ stress på grund av dysfunktion av pentofosfatvägen7,11, 12. Dessutom, nyare studier från laboratoriet har belyst en patofysiologisk roll för ROS i A-T genom att förändra cytoskelettets dynamik (dvs. adhesion och spridning) som en direkt följd av aktivering av Rho familjen GTPases in vitro-5. Islutändan kan dessa förändringar i cytoskeletala dynamik orsakade av Rho familj aktivering leda till den ökade risken för metastaserad cancer noteras i A-T patienter5,13. Därför, förstå samspelet mellan cell-matris interaktioner under oxidativ stress kan ge insikter i regleringen av adhesion och spridning. Dessa studier kan också sätta scenen för ytterligare utredningar av en möjlig roll för Rho-familjen GTPases i dessa signaleringsprocesser.
Beskrivs häri är ett protokoll för att studera den tidiga cellulära dynamiken i adhesion församling och sprider sig under oxidativ stress orsakad av hämning av ATM Kinas aktivitet. Denna analys är baserad på den väl karakteriserade mekanismen för Anchorage-beroende celler vidhäftning till ECM-proteinet Fibronektin (FN). När celler som upprätthålls i suspensionen är pläterade på FN, flera Rho gtpases samordna kontrollen av aktin cytoskeletala remodeling3,14. Morfologiska förändringar observeras som celler skiftar från runda och cirkulära utseende till tillplattad och expanderad. Samtidig med dessa observationer är utvecklingen av många Matrix sammanväxningar med ECM. Dessa förändringar tillskrivs bifasisk aktivering av RhoA med Rac1 under den första timmen som celler fäster och sprider 15,16.
En mängd olika metoder har utnyttjats för att undersöka vidhäftnings morfologi och dynamik samt cell spridning. Men dessa metoder förlitar sig på sofistikerade långsiktig, Live-avbildning totalt inre reflektion fluorescens (TIRF) eller konfokala mikroskopi system. Därför måste användarna ha tillgång till specialiserad utrustning och programvara. Dessutom gör den inställda tid som krävs av dessa bio-Imaging system fånga tidiga vidhäftnings händelser utmanande, särskilt när man testar flera inhibitorer eller behandlings villkor samtidigt.
Metoderna detaljerade, häri, ger ett enkelt, ekonomiskt, men ändå kvantitativt sätt att bedöma parametrar som styr vidhäftning församlingen och sprider in vitro-. Protokollet utförs med hjälp av allmänt tillgänglig laboratorieutrustning, såsom ett epifluorescensmikroskop och CCD-kamera. Denna analys innebär att tillämpa Anchorage-beroende celler till en FN-belagd yta efter en period av oxidativ stress orsakad av kemisk hämning av ATM Kinas aktivitet, som har visats tidigare5. Efter plätering, celler får fästa och fästa för specificerade längder av tid. Okopplade celler tvättas bort, medan bifogade celler är fasta och märkta med fluorescensbaserade antikroppar mot markörer för vidhäftning (t. ex. paxillin) och spridning (t. ex., F-Actin)2,5. Dessa proteiner visualiseras och registreras med hjälp av ett epifluorescensmikroskop. Efterföljande dataanalys utförs med hjälp av fritt tillgängliga Fiji programvara. Dessutom kan denna metod anpassas för att undersöka vidhäftnings dynamik under ett brett spektrum av förhållanden, inklusive olika ECM-proteiner, behandling med olika oxidanter/cell odlingsförhållanden eller en mängd olika förankrings beroende cellinjer för att ta itu med ett brett spektrum av biologiska frågor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs här är ett mångsidigt och ekonomiskt sätt att snabbt skärmen ett antal förankrings beroende celltyper för dynamisk cytoskelettet remodeling under cell spridning. I synnerhet, denna metod undersöker kvantitativt stress fiber och fokal vidhäftnings bildning under oxidativ stress när cellerna följer FN (figur 1a). Dessutom kan dessa cellulära fenotyper föreslå en reglerande roll för medlemmar i Rho familj av små gtpases eftersom de har dokumenterade ro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar DRS. Scott R. Hutton och Meghan S. Blackledge för den kritiska granskningen av manuskriptet. Detta arbete finansierades av High Point University ‘ s Research and sponsrade program (MCS) och bioteknikprogrammet vid North Carolina State University (MCS).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
Referências
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix–cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).
- Lawson, C. D., Burridge, K. The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration. Small GTPases. 5, e27958 (2014).
- Heo, J., Campbell, S. L. Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).
- Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).
- Hobbs, G. A., et al. Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation. Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).
- Zhang, Y., et al. Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity. Science Signaling. 11 (538), (2018).
- Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. Rho GTPases, oxidation, and cell redox control. Small GTPases. 5, e28579 (2014).
- Shiloh, Y., Ziv, Y. The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).
- Lang, L., et al. ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).
- Peter, Y., et al. Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice. European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).
- Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress. Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).
- Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond. Pharmacology & Therapeutics. 183, 1-21 (2018).
- Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1. Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).
- Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism. Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).
- Arthur, W. T., Burridge, K. RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).
- Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).
- Fitzpatrick, M. . Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).
- Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells. PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Elosegui-Artola, A., et al. Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions. PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).
- Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration. Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).
- Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Kumar, A., et al. Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).
- Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
- Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy. Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).
- Brown, M. A., et al. The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces. Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).
