إحداث إصابات الرئة الحادة في الفئران عن طريق التبيل المباشر للكيس الشحمي داخل الرغامى
Summary
يقدم هنا إجراء خطوة بخطوة للحث على إصابة الرئة الحادة في الفئران عن طريق مباشرة داخل الرغامى السكاريد ولإجراء تحليل FACS عينات الدم، والسائل القصبات الهوائية، وأنسجة الرئة. الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقابلية للتكرار الجيد، ومعايرة شدة المرض هي مزايا هذا النهج.
Abstract
إدارة مجرى الهواء من السكاريد (LPS) هو وسيلة شائعة لدراسة التهاب رئوي وإصابة الرئة الحادة (ALI) في النماذج الحيوانية الصغيرة. وقد وصفت نُهج مختلفة، مثل استنشاق الهباء الجوي وغرس الأنف أو داخل الرغامى. يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تهيئة LPS داخل الرغامى مباشرة وإجراء تحليل FACS لعينات الدم، وسوائل غسل القصبات (BAL)، وأنسجة الرئة. بعد التخدير داخل الحَرَب، يتم تعريض القصبة الهوائية وتدار الـ LPS بواسطة قسطرة وريديّة 22 G. يتم التسبب في رد فعل التهابي قوي وقابل للتكرار مع غزو الكريات البيض ، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory ، وتعطيل حاجز الحويفين الشعري في غضون ساعات إلى أيام ، اعتمادا على جرعة LPS المستخدمة. يتم وصف جمع عينات الدم، والسائل BAL، وحصاد الرئة، فضلا عن معالجة لتحليل FACS، بالتفصيل في البروتوكول. على الرغم من أن استخدام LPS المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، فإن النهج الموصوف يقدم الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقدرة على استنساخ جيدة للرد على الأسئلة المناعية الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، فإن المعايرة بالتحليل الكيميائي للجرعة، فضلا عن استخدام الاستعدادات البديلة لـ LPS أو سلالات الماوس تسمح بتحوير الآثار السريرية، والتي يمكن أن تظهر درجات مختلفة من شدة ALI أو في وقت مبكر مقابل بداية متأخرة من أعراض المرض.
Introduction
النماذج الحيوانية التجريبية لا غنى عنها في البحوث المناعية الأساسية. وقد استخدمت إدارة البكتيريا الكاملة أو المكونات الميكروبية في كثير من الأحيان في النماذج الحيوانية الصغيرة للحث على التهاب محلي أو نظامي1. Lipopolysaccharide (LPS، أو التوكسين البكتيري) هو مكون جدار الخلية ومستضد السطح من البكتيريا السالبة للجرام (على سبيل المثال، البكتيريا المعوية، الزائفة spp.، أو الفيلق spp.). يتكون الجزيء المستقرة بالحرارة والكبيرة (الوزن الجزيئي 1-4 × 106 kDa) من مويتي الدهون (الدهون A)، ومنطقة أساسية (oligosaccharide)، وO السكريات (أو مستضد). الدهون A، مع سلاسل الأحماض الدهنية المسعورة، يرسو الجزيء في غشاء بكتيري وتوسط (على تدهور البكتيريا) النشاط المناعي وسمية LPS. بعد الربط إلى البروتين ملزم LPS (LBP)، LPS: مجمع LBP ligate مجمع مستقبلات CD14/TLR4/MD2 تقع على سطح العديد من أنواع الخلايا، مما يؤدي إلى رد فعل proinflammatory قوي مع NF-κB نقل النووية وupregulation اللاحقة من السيتوكين التعبير2.
يتم تعريف إصابة الرئة الحادة (ALI) بأنها فشل الجهاز التنفسي الحاد مع وذمة رئوية ثنائية في غياب فشل القلب3. إدارة مجرى الهواء من LPS هو وسيلة شائعة للحث على التهاب رئوي وعلي4،5،6،7. على الرغم من أن المادة المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، يمكن الإجابة على الأسئلة المناعية الميكانيكية بدقة كافية. غرس LPS في القصبة الهوائية يحفز على رد فعل التهابي قوي مع غزو الكريات البيض، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory، وتعطيل حاجز الحويفين الشعرية في غضون ساعات إلى أيام، اعتمادا على جرعة LPS3، 6,7.
يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تبيل LPS داخل الرغامى. تم التحقق من صحة النموذج من خلال تقييم التعبير السيتوكين، غزو المحببة العدلية، وتسرب الألبومين داخل الحُقف كما سبق وصفه8.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، وتكرار جيد هي السمات الرئيسية للنهج المقدم للحث على ALI في نموذج القوارض الصغيرة. استخدام LPS بدلا من البكتيريا كلها في النماذج الحيوانية له مزايا. وهو مركب مستقر ونقي ويمكن تخزينها في شكل الليوفيليز حتى الاستخدام. وهو منبه قوي للاستجابات المناعية الف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا جان كلينر وسوزان شولتز على تقديم الدعم التقني. ويقر المؤلفون بالدعم الممتاز الذي يقدمه المرفق الأساسي للقياس الدفقي في كلية الطب بجامعة بون. ولم يتلق المؤلفون أي تمويل من أي منظمة خارجية. وقد سبق أن عرض جزء من البيانات الواردة في قسم النتائج والمبينة في الشكل 3 في منشور سابقرقم 8.
Materials
| 1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
| 10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
| Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
| C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
| CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
| Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
| Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
| Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
| Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
| FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
| Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
| Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
| Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
| Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
| Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |
References
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -. C., Yeh, W. -. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).
- Rabelo, M. A. E., et al. Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase. Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).
- Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 304, 158-166 (2013).
- Rittirsch, D., et al. Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation. Journal of Immunology. 180 (11), 7664-7672 (2008).
- D’Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages. Journal of Inflammation. 15, 12 (2018).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).
- Hoegl, S., et al. Capturing the multifactorial nature of ARDS – approach to model murine acute lung injury. Physiological Reports. 6 (6), (2018).
- Weisheit, C., et al. Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload. PLoS ONE. 9 (11), (2014).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury. Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).
- Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives. Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).
- Fujita, M., et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).
- Doyen, V., et al. Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers. British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).
- Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice. Physiological Reports. 3 (11), (2015).
- Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles. Shock. 47 (3), 378-384 (2017).
