Представлено здесь пошаговая процедура, чтобы вызвать острую травму легких у мышей путем прямого внутричехального липополисахарида закапывания и для выполнения FACS анализ образцов крови, бронхоальвеолярной жидкости для вавания, и легочной ткани. Минимальная инвазивность, простая обработка, хорошая воспроизводимость, и титрование тяжести заболевания являются преимуществами этого подхода.
Администрация дыхательных путей липополисахарида (LPS) является распространенным способом изучения воспаления легких и острой травмы легких (ALI) в малых моделей животных. Были описаны различные подходы, такие как вдыхание аэрозольных ЛПС, а также носовое или внутримагистральное заволакивание. Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем прямого внутрипеченого зависания ЛПС и выполнения анализа FACS образцов крови, бронхоальвеолярной провай (BAL) жидкости и легочной ткани. После интраперитонеальной седации трахея подвергается воздействию и LPS вводится через 22 G венозного катетера. Надежная и воспроизводимая воспалительная реакция с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера индуцируется в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозы LPS используется. Сбор образцов крови, BAL жидкости, и вырубка легких, а также обработки для анализа FACS, подробно описаны в протоколе. Хотя использование стерильных LPS не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, описанный подход предлагает минимальную инвазивность, простое обращение и хорошую воспроизводимость для ответа на механистические иммунологические вопросы. Кроме того, доза титрации, а также использование альтернативных препаратов LPS или мыши штаммов позволяют модуляции клинических эффектов, которые могут проявлять различные степени али тяжести или раннего против позднего начала симптомов заболевания.
Экспериментальные модели животных незаменимы в фундаментальных иммунных исследованиях. Администрация целых бактерий или микробных компонентов часто используется в небольшихмоделях животных, чтобы вызвать местное или системное воспаление 1. Липополисахарид (LPS, или бактериальный эндотоксин) является компонентом стенки клетки и поверхностным антигеном грамотрицательных бактерий (например, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., или Legionella spp.). Термостабильная и большая молекула (молекулярный вес 1-4 х 106 кДА) состоит из липидного муати (Липид A), основной области (олигосахарид) и ополисахарида (или O антигена). Липид А, с его гидрофобными цепями жирных кислот, закрепляет молекулу в бактериальной мембране и опосредует (после деградации бактерий) иммунологическую активность и токсичность ЛПС. После связывания с связывающим белком LPS (LBP), комплексы LPS:LBP сводят сягирование рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, расположенного на поверхности многих типов клеток, вызывая сильную провоспалительную реакцию с ядерной транслокацией NF-QB и последующее регулирование цитокинов выражение2.
Острая травма легких (АЛИ) определяется как острая гипоксемическая дыхательная недостаточность с двусторонним отеком легких при отсутствии сердечной недостаточности3. Администрация дыхательных путей LPS является распространенным способом вызвать воспаление легких и ALI4,5,6,7. Хотя стерильное вещество не подходит для изучения фармакологических вмешательств при инфекционных заболеваниях, на механистические иммунологические вопросы можно ответить с достаточной точностью. Привитие ЛПС в трахею вызывает надежную воспалительную реакцию с нашествием лейкоцитов, upregulation провоспалительных цитокинов, и нарушение альвеоло-капиллярного барьера в течение нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от дозировки LPS3, 6,7.
Представленный протокол описывает подробную пошаговую процедуру, чтобы вызвать АЛИ у мышей путем внутричехального зависания ЛПС. Модель была подтверждена путем оценки экспрессии цитокинов, нейтрофилов гранулоцитов вторжения, и внутриальвеолярной утечки альбумин, как ранее описано8.
Минимальная инвазивность, простая обработка и хорошая воспроизводимость являются ключевыми особенностями представленного подхода, чтобы побудить ALI в небольшой модели грызунов. Использование LPS вместо целых бактерий в животных моделях имеет свои преимущества. Это стабильное и чисто?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Яна Кляйнера и Сюзанну Шульц за техническую поддержку. Авторы признают отличную поддержку потока цитометрии основной объект на медицинском факультете Боннского университета. Авторы не получали финансирования от какой-либо внешней организации. Часть данных, приведенных в разделе результатов и изображенных на рисунке 3, уже была показана в предыдущей публикации8.
1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |