这里介绍的是一个逐步的过程,通过直接的内切内脂多糖灌输诱导小鼠急性肺损伤,并执行FACS分析血液样本,支气管洗浴液和肺组织。微创性、简单处理、良好的可重复性和疾病严重程度的滴定是这种方法的优点。
脂多糖(LPS)气道管理是研究小动物模型中肺部炎症和急性肺损伤(ALI)的常用方法。已经描述了各种方法,例如吸入气溶胶LPS以及鼻腔或内气浸灌输。提出的方案描述了通过直接宫内LPS灌输诱导小鼠ALI的详细分步程序,并执行对血液样本、支气管性(BAL)液体和肺组织的FACS分析。腹管内镇化后,气管暴露,LPS通过22G静脉导管施用。根据使用的LPS剂量,在数到几天内诱导一种强健且可重复的炎症反应,其内为白细胞入侵、前列腺炎细胞因子的增调和白细胞屏障的中断。协议详细介绍了采集血液样本、BAL液体和肺采集以及FACS分析的处理。虽然无菌LPS的使用不适合研究传染病的药理干预,但所述方法提供最小的侵入性、简单的处理和良好的可重复性来回答机械免疫学问题。此外,剂量滴定以及使用替代LPS制剂或小鼠菌株允许调节临床效果,这可能表现出不同程度的ALI严重程度或早期与晚发病症状。
实验动物模型在基础免疫研究中不可或缺。管理整个细菌或微生物成分已经常用于小动物模型,以诱发局部或全身炎症1。脂多糖(LPS,或细菌内毒素)是一种细胞壁成分和克阴性细菌的表面抗原(例如,肠杆菌、伪多糖,或军团菌)。热稳定和大分子(分子量1-4 x 106 kDa)由脂质莫伊蒂(脂质A)、核心区域(寡糖)和O多糖(或O抗原)组成。脂质A,其疏水性脂肪酸链,锚定分子到细菌膜和调解(在细菌降解)的免疫活性和毒性的LPS。继与LPS结合蛋白(LBP)结合后,LPS:LBP复合物可使位于许多细胞类型的表面的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合,通过NF-βB核易位和随后的上升调节诱导强烈的前列腺炎反应细胞因子表达2。
急性肺损伤(ALI)被定义为急性低氧呼吸衰竭与双边肺水肿,在没有心力衰竭3。LPS的气道管理是诱发肺部炎症和ALI4,5,6,7的常见方法。虽然无菌物质不适合研究传染病的药理干预,但机械免疫学问题可以足够精确地回答。LPS 注入气管诱导强大的炎症反应与白细胞入侵, 前列腺炎细胞因子的调节, 和中断的白细胞 – 毛细血管屏障在几个小时到几天内, 取决于 LPS 剂量3, 6,7.
提出的协议描述了通过内切液LPS灌输诱导小鼠的ALI的详细分步程序。该模型已经通过评估细胞因子表达、中性粒细胞细胞入侵和肺泡内白蛋白泄漏进行了验证,如前所述8。
微创性、简单处理和良好的可重复性是所呈现的方法的关键特征,用于在小型啮齿动物模型中诱导 ALI。在动物模型中使用LPS代替整个细菌具有优势。它是一种稳定和纯净的化合物,可以储存在冻干形式,直到使用。它是通过TLR4途径进行先天免疫反应的有力兴奋剂,其生物活性易于量化,促进疾病严重程度的滴定,具有良好的可重复性。此外,使用LPS已被证明作为安全模型,诱导急性支气管炎在人类健康志愿…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢扬·克莱纳和苏珊娜·舒尔茨提供技术支持。作者肯定了波恩大学医学院对流式细胞学核心设施的出色支持。提交人没有得到任何外部组织的任何资助。 结果部分给出如图3所示的部分数据已在上一份出版物8中显示。
1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |