タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識
Summary
このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。
Abstract
ミトコンドリアヌクレオイドは、ミトコンドリアDNA分子によって形成されるコンパクトな粒子であり、タンパク質で被覆される。ミトコンドリアDNAは、tRNA、rRNA、およびいくつかの必須のミトコンドリアポリペプチドをコードする。ミトコンドリア核は、核分裂/融合および他の形態学的変化を受ける動的ミトコンドリアネットワーク内で分裂し、分布する。高解像度ライブ蛍光顕微鏡は、核酸の位置と動きを特徴付けるための簡単な技術です。この技術では、ヌクレオイドは、一般に、それらのタンパク質成分、すなわち転写因子a(TFAM)の蛍光タグを介して標識される。しかし、この戦略は、蛍光タンパク質タグ付き構築物の過剰発現を必要とし、アーティファクト(TFAMについて報告)を引き起こす可能性があり、多くの場合実現不可能である。有機DNA結合色素はこれらの欠点を有しない。しかし、彼らは常に核およびミトコンドリアDNAの染色を示し、したがってミトコンドリアヌクレオイドに特異性を欠いている。このような色素の物理化学的性質を考慮して、核酸ゲル染色(SYBR Gold)を選択し、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの優先標識を達成した。色素の特性、特にDNAに結合する際の高輝度は、超解像構造照明画像の時系列を用いてミトコンドリア核体運動のその後の定量化を可能にする。
Introduction
円形の16.5kbp DNA分子はミトコンドリアの遺伝物質を構成し、ミトコンドリア酸化リン酸化複合体に必要な22のtRNA、2つのrRNA、および13のポリペプチドをコードする。ミトコンドリア転写因子a(TFAM)および他のいくつかのタンパク質に結合したミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアヌクレオイド11、2、3、42,3,4を形成する。ミトコンドリア核は、ミトコンドリアネットワーク55、66の成分間で移動し、再分配し、その形態学的改変、分裂または融合は細胞周期相、応力、および他の要因に応じて(Pernas et7.また、ミトコンドリアヌクレオイドの運動は、全身性エリテマトーデス病8に関与し、他の疾患に関与しうる。蛍光顕微鏡は、オルガネラの生細胞研究のための簡単な技術であるが、この技術は、ミトコンドリアヌクレオイドのサイズよりも大きい>200nmの解像度を有する(〜100 nm99、10、11、12)。10,11,12この限界は、刺激放出枯渇(STED)および単一分子局在化顕微鏡(SMLM)13,14のようないわゆる「超解像」技術によって回避された。13,14これまで、ミトコンドリアヌクレオイドおよび他のDNAは、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)15によって生細胞で画像化された。15mtDNAと相関する位置を有する微細なサブミトコンドリア構造は、生細胞16においてSTEDにより観察された。しかしながら、これらの超解像技術は高い照明強度を必要とし、生細胞17に光毒性作用を引き起こす。したがって、回折限界を超える解像度を有するミトコンドリアヌクレオイドのタイムラプスイメージングは困難である。これに対処するために、我々は超解像構造照明顕微鏡(SR-SIM)1818を使用した。SIM は、STED および SMLM19よりもはるかに低い照明電力線量を必要とします。さらに、STEDおよびSMLM技術とは対照的に、SIMは単純な多色三次元(3D)イメージングを可能にし、フルオロフォアまたはイメージングバッファ組成物19の特定の光物性を必要としない。
生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの標識に関する従来の戦略は、TFAM20のようなミトコンドリアヌクレオイドタンパク質の蛍光タグ付けである。しかし、多くの場合、この戦略は適していません。さらに、蛍光タンパク質タグ付きTFAMの過剰発現は、深刻な人工物21を生成する。有機色素によるDNAの標識は、蛍光タンパク質(FP)ベースの戦略よりも優れた効果があります。有機色素はFPタグに関連する制約がない:それらは細胞または組織の任意のタイプに使用することができ、実験の任意の時点で適用することができる。ミトコンドリアヌクレオイドの生細胞イメージングは、いくつかのDNA結合色素で報告されている:DAPI2222、SYBRグリーン23、ヴィブラントDyeCycle24、およびピコグリーン15、25、26。15,25,26ヌクレオイド標識のためのほとんどのDNA結合色素の実質的な欠点は、それらが細胞内のすべてのDNAを染色することです。ミトコンドリアDNAのみに対する色素の標的化は非常に望ましい。そのためには、適切な物理化学的性質を有する色素を慎重に選択することが必要である。ローダミン123のような非局所陽性電荷を有する親油性染料は、その陰性膜電位を保持する生のミトコンドリアに蓄積することが知られている。さらに、ミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識に理想的な色素は、高い親和性を持つDNAを結合し、DNA結合時に明るい蛍光を発する必要があります。これらの要件を考慮すると、特定のシアニン(例えば、ピコグリーン)が有望であるが、核DNAはミトコンドリアDNA15、25、26,25,26と同時にこれらの染料によって豊富に染色される。本プロトコルは、別のシアニン色素を有する生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、SYBR Gold(SG)、および時間経過超解像SIMビデオにおける核oidの追跡について説明する。また、SG染色された生細胞は、生細胞に適したあらゆる種類の反転蛍光顕微鏡(共焦点、紡績円盤、蛍光等)で、488nmの光源を備えて画像化することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルにはいくつかの重要な要素があります:ミトコンドリアDNAの優先標識を達成するために、インキュベーション中のDNA結合色素の濃度は非常に低く(例えば、典型的な商業ストックの1:10,000希釈)、およびインキュベーション時間は30分であるべきです。インキュベーション時間は1時間を超えてはならない SYBR ゴールド染料を使用する必要があります。他のDNA結合色素は、低濃度で標識?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、HeLa細胞を提供したアシファ・アフタールとアンジェリカ・ランボルト(マックス・プランク免疫生物学・エピジェネティクス研究所の両方)を認めている。
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
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