Specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider til tidsforfald struktureret belysning mikroskopi
Summary
Protokollen beskriver specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider med en kommercielt tilgængelig DNA gel plet, erhvervelse af tid bortfalder serie af levende mærket celler ved super-opløsning struktureret belysning mikroskopi (SR-SIM), og automatisk sporing af nukleoid bevægelse.
Abstract
Mitokondrielle nukleoider er kompakte partikler dannet af mitokondrielle DNA-molekyler belagt med proteiner. Mitokondrielle DNA koder tRNAs, rRNAs, og flere væsentlige mitokondrielle polypeptider. Mitokondrielle nukleoider deler og distribuerer inden for det dynamiske mitokondrielle netværk, der gennemgår fission /fusion og andre morfologiske ændringer. Høj opløsning levende fluorescens mikroskopi er en enkel teknik til at karakterisere en nukleoid position og bevægelse. Til denne teknik er nukleoider almindeligt mærket gennem fluorescerende tags af deres proteinkomponenter, nemlig transskriptionsfaktor a (TFAM). Men denne strategi har brug for overekspression af en fluorescerende protein-mærket konstruktion, som kan forårsage artefakter (rapporteret for TFAM), og er ikke muligt i mange tilfælde. Organiske DNA-bindende farvestoffer har ikke disse ulemper. Men de viser altid farvning af både nukleare og mitokondrielle DNAs, og dermed mangler specificitet til mitokondrielle nukleoider. Ved at tage hensyn til sådanne farvestoffers fysisk-kemiske egenskaber valgte vi en nukleinsyregelplet (SYBR Gold) og opnåede præferencemærkning af mitokondrielle nukleoider i levende celler. Farvestoffets egenskaber, især dets høje lysstyrke ved binding til DNA, tillader efterfølgende kvantificering af mitokondriel nukleoid bevægelse ved hjælp af tidsserier af superopløsningsstrukturerede belysningsbilleder.
Introduction
Cirkulære 16,5 kbp DNA-molekyler udgør det genetiske materiale af mitokondrier, kodning 22 tRNAs, 2 rRNAs, og 13 polypeptider er nødvendige for mitokondrielle oxidative fosforylering komplekser. Mitokondrielt DNA bundet til mitokondriel transskriptionsfaktor a (TFAM) og flere andre proteiner danner mitokondrielle nukleoider1,2,3,4. Mitokondrielle nukleoider bevæger sig og omfordeler mellem komponenterne i mitokondrielle netværk5,6 under dets morfologiske ombygning, fission eller fusion afhængigt af cellecyklusfase, stress og andre faktorer (gennemgået i Pernas et al.7). Desuden er bevægelsen af mitokondrielle nukleoider, involveret i systemisk lupus erythematosus sygdom8 og kan spille en rolle i andre sygdomme. Fluorescensmikroskopi er en enkel teknik til live-celle undersøgelser af organeller, men teknikken har en opløsning på >200 nm, hvilket er større end størrelsen af mitokondrielle nukleoider (~ 100 nm9,10,11,12). Denne grænse er blevet omgået ved såkaldte “super-resolution”-teknikker, såsom stimuleret emissionsudtømning (STED) og enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM)13,14. Hidtil har mitokondrielle nukleoider og andre DNAs blev afbildet i levende celler ved direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM)15. Fine submidelige strukturer med positioner korreleret med mtDNA blev observeret af STED i levende celler16. Disse superopløsningsteknikker kræver imidlertid høj belysningsintensitet, hvilket forårsager fototoksiske virkninger på levende celler17. Derfor er tid bortfalder billeddannelse af mitokondrielle nukleoider med opløsning ud over diffraktion grænse udfordrende. For at løse dette, brugte vi super-opløsning struktureret belysning mikroskopi (SR-SIM)18. SIM kræver en meget lavere belysningseffektdosis end STED og SMLM19. I modsætning til STED- og SMLM-teknikker tillader SIM desuden enkel flerfarvet tredimensional (3D) billeddannelse, og det kræver ikke særlige fotofysiske egenskaber af fluorophores eller billeddannelsesbuffersammensætning19.
Den konventionelle strategi for mærkning mitokondrielle nukleoider i levende celler er fluorescerende tagging af et mitokondrielt nukleoid protein, såsom TFAM20. I mange tilfælde er denne strategi imidlertid ikke egnet. Desuden, overekspression af fluorescerende protein-mærkede TFAM producerer en alvorlig artefakt21. Mærkning af DNA med organiske farvestoffer har fordele i forhold til en fluorescerende protein (FP)-baseret strategi. Organiske farvestoffer er fri for begrænsninger i forbindelse med FP-mærkning: de kan anvendes til enhver type celler eller væv og kan anvendes på ethvert tidspunkt af et eksperiment. Levende celle billeddannelse af mitokondrielle nukleoider er blevet rapporteret med flere DNA-bindende farvestoffer: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, og picoGreen15,25,26. En væsentlig ulempe ved de fleste DNA-bindende farvestoffer til nukleoid mærkning er, at de pletter alle DNA i cellen. Målretning et farvestof udelukkende til mitokondrie DNA er meget ønskeligt. For at opnå dette, omhyggelig udvælgelse af et farvestof besidder egnede fysisk-kemiske egenskaber er nødvendig. Lipofile farvestoffer besidder delocalized positiv ladning, såsom rhodamin 123, er kendt for at ophobe sig i levende mitokondrier, som bevarer deres negative membran potentiale. Desuden bør et ideelt farvestof til specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider binde DNA med høj affinitet og udsender lys fluorescens ved DNA-binding. I betragtning af disse krav, visse cyaniner er lovende (f.eks picoGreen), men nukleare DNA er rigeligt plettet af disse farvestoffer samtidig med mitokondriel DNA15,25,26. Denne protokol beskriver specifik mærkning af mitokondrielle nukleoider i levende celler med en anden cyanin farvestof, SYBR Gold (SG), og sporing af nukleoider i time lapse super-opløsning SIM-videoer. Desuden kan SG-farvede levende celler afbildes ved enhver form for omvendt fluorescerende mikroskop (konfokal, spinning disk, epifluorescens, osv.) egnet til levende celler og udstyret med en 488 nm lyskilde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske komponenter i protokollen: For at opnå præferencemærkning af mitokondrielt DNA skal koncentrationen af DNA-bindende farvestof under inkubation holdes meget lav (f.eks. en 1:10.000 fortynding af et typisk kommercielt lager), og inkubationstiden skal være 30 min. Inkubationstiden må aldrig overstige 1 h. SYBR Gold-farvestoffet bør anvendes. andre DNA-bindende farvestoffer er ikke lyse nok til at generere et stærkt signal ved mærkning ved lav koncentration.
Begrænsn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Asifa Akhtar og Angelika Rambold (både Max Planck Institut for Immunobiology og Epigenetics) for at give HeLa celler.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
