Spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden für die Zeitraffer-Struktur-Beleuchtungsmikroskopie
Summary
Das Protokoll beschreibt die spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden mit einem handelsüblichen DNA-Gelfleck, die Erfassung von Zeitrafferserien von Live-beschrifteten Zellen durch superauflösungsstrukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SR-SIM) und die automatische Verfolgung von Nukleoidbewegungen.
Abstract
Mitochondriale Nukleoide sind kompakte Teilchen, die aus mitochondrialen DNA-Molekülen gebildet werden, die mit Proteinen beschichtet sind. Mitochondriale DNA kodiert tRNAs, rRNAs und mehrere wesentliche mitochondriale Polypeptide. Mitochondriale Nukleoide teilen und verteilen sich innerhalb des dynamischen mitochondrialen Netzwerks, das Spalt/Fusion und andere morphologische Veränderungen durchläuft. Die hochauflösende Live-Fluoreszenzmikroskopie ist eine einfache Technik, um die Position und Bewegung eines Nukleoids zu charakterisieren. Für diese Technik werden Nukleoide häufig durch fluoreszierende Tags ihrer Proteinkomponenten, nämlich Transkriptionsfaktor a (TFAM), gekennzeichnet. Diese Strategie erfordert jedoch eine Überexpression eines fluoreszierenden Protein-tagged-Konstrukts, das Artefakte verursachen kann (für TFAM gemeldet), und in vielen Fällen nicht durchführbar ist. Organische DNA-bindende Farbstoffe haben diese Nachteile nicht. Sie zeigen jedoch immer eine Färbung sowohl der nuklearen als auch der mitochondrialen DNAs, so dass es an Spezifität für mitochondriale Nukleoide fehlt. Unter Berücksichtigung der physikalisch-chemischen Eigenschaften solcher Farbstoffe wählten wir einen Nukleinsäure-Gelfleck (SYBR Gold) aus und erreichten eine bevorzugte Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden in lebenden Zellen. Die Eigenschaften des Farbstoffs, insbesondere seine hohe Helligkeit bei Bindung an die DNA, ermöglichen eine nachträgliche Quantifizierung der mitochondrialen Nukleoidbewegung mittels Zeitreihen von superauflösenden strukturierten Beleuchtungsbildern.
Introduction
Zirkuläre 16,5 kbp DNA-Moleküle bilden das genetische Material von Mitochondrien, die 22 tRNAs, 2 rRNAs und 13 Polypeptide kodieren, die für mitochondriale oxidative Phosphorylierungskomplexe benötigt werden. Mitochondriale DNA gebunden an mitochondrialen Transkriptionsfaktor a (TFAM) und mehrere andere Proteine bilden die mitochondrialen Nukleoide1,2,3,4. Mitochondriale Nukleoide bewegen und verteilen sich zwischen den Komponenten des mitochondrialen Netzwerks5,6 während seiner morphologischen Umgestaltung, Spaltung oder Fusion je nach Zellzyklusphase, Stress und anderen Faktoren (in Pernas et al.7). Darüber hinaus ist die Bewegung von mitochondrialen Nukleoiden an der systemischen Lupus erythematodes-Krankheit8 beteiligt und kann bei anderen Krankheiten eine Rolle spielen. Fluoreszenzmikroskopie ist eine einfache Technik für Live-Zell-Studien von Organellen, aber die Technik hat eine Auflösung von >200 nm, die größer ist als die Größe der mitochondrialen Nukleoide (ca. 100 nm9,10,11,12). Diese Grenze wurde durch sogenannte “Super-Resolution”-Techniken wie stimulierte Emissionserschöpfung (STED) und Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM)13,14umgangen. Bisher wurden mitochondriale Nukleoide und andere DNAs in lebenden Zellen durch direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)15abgebildet. Feine submitochondriale Strukturen mit Positionen, die mit mtDNA korrelierten, wurden von STED in lebenden Zellen16beobachtet. Diese Super-Resolution-Techniken erfordern jedoch eine hohe Beleuchtungsintensität, die phototoxische Effekte auf lebende Zellen verursacht17. Daher ist die Zeitraffer-Bildgebung von mitochondrialen Nukleoiden mit einer Auflösung jenseits der Beugungsgrenze eine Herausforderung. Um diesem Problem zu begegnen, haben wir eine superhochauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SR-SIM)18verwendet. SIM erfordert eine viel geringere Beleuchtungsleistung als STED und SMLM19. Darüber hinaus ermöglicht SIM im Gegensatz zu STED- und SMLM-Techniken eine einfache mehrfarbige dreidimensionale (3D) Bildgebung und erfordert keine besonderen photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore oder der bildgebenden Pufferzusammensetzung19.
Die herkömmliche Strategie zur Kennzeichnung mitochondrialer Nukleoide in lebenden Zellen ist die fluoreszierende Kennzeichnung eines mitochondrialen Nukleoidproteins wie TFAM20. In vielen Fällen ist diese Strategie jedoch nicht geeignet. Darüber hinaus erzeugt die Überexpression von fluoreszierendem, proteingetaggten TFAM ein ernstes Artefakt21. Die Kennzeichnung von DNA mit organischen Farbstoffen hat Vorteile gegenüber einer auf Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Strategie. Organische Farbstoffe sind frei von Einschränkungen im Zusammenhang mit FP-Tagging: Sie können für jede Art von Zellen oder Gewebe verwendet werden und können zu jedem Zeitpunkt eines Experiments angewendet werden. Live-Zell-Bildgebung von mitochondrialen Nukleoiden wurde mit mehreren DNA-bindenden Farbstoffen berichtet: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24und picoGreen15,25,26. Ein wesentlicher Nachteil der meisten DNA-bindenden Farbstoffe für die Nukleoid-Etikettierung ist, dass sie die gesamte DNA innerhalb der Zelle färben. Es ist sehr wünschenswert, einen Farbstoff ausschließlich auf mitochondriale DNA auszurichten. Um dies zu erreichen, ist eine sorgfältige Auswahl eines Farbstoffs mit geeigneten physikalisch-chemischen Eigenschaften erforderlich. Lipophile Farbstoffe, die eine delokalisierte positive Ladung besitzen, wie Rhodamine 123, sind dafür bekannt, sich in lebenden Mitochondrien anzusammeln, die ihr negatives Membranpotenzial erhalten. Darüber hinaus sollte ein idealer Farbstoff für die spezifische Etikettierung von mitochondrialen Nukleoiden DNA mit hoher Affinität binden und helle Fluoreszenz bei DNA-Bindung emittieren. Unter Berücksichtigung dieser Anforderungen sind bestimmte Cyanine vielversprechend (z.B. picoGreen), aber Kern-DNA wird reichlich durch diese Farbstoffe gleichzeitig mit mitochondrialer DNA15,25,26gefärbt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die spezifische Kennzeichnung von mitochondrialen Nukleoiden in lebenden Zellen mit einem anderen Cyaninfarbstoff, SYBR Gold (SG), und die Verfolgung der Nukleoide in Zeitraffer-SIM-Videos mit superauflösung. Darüber hinaus können SG-befleckte lebende Zellen mit jeder Art von invertiertem Fluoreszenzmikroskop (konfokale, Spinnscheibe, Epifluoreszenz usw.) abgebildet werden, das für lebende Zellen geeignet ist und mit einer 488 nm Lichtquelle ausgestattet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere kritische Komponenten des Protokolls: Um eine bevorzugte Kennzeichnung der mitochondrialen DNA zu erreichen, sollte die Konzentration des DNA-Bindungsfarbstoffs während der Inkubation sehr gering gehalten werden (z. B. eine Verdünnung eines typischen handelsüblichen Bestands von 1:10.000), und die Inkubationszeit sollte 30 min betragen. Die Inkubationszeit sollte niemals 1 h überschreiten. SYBR Goldfarbstoff sollte verwendet werden; andere DNA-bindende Farbstoffe sind nicht hell genug, um bei der Etik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würdigen Asifa Akhtar und Angelika Rambold (beide Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik) für die Bereitstellung von HeLa-Zellen.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
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