תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים לזמן-מיקרוסקופ תאורה מובנה לפקיעה
Summary
הפרוטוקול מתאר את התיוג הספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם כתם של דנ א הזמין מסחרית, רכישת סדרה של לשגות בזמן של תאים בעלי תווית חיה על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SR-SIM), ומעקב אוטומטי של תנועה נוקלאואידית.
Abstract
נוקלאונואידים מדריאידים הם חלקיקים קומפקטית שנוצרו על ידי מולקולות DNA מיטוכונדריאלי מצופה חלבונים. דנ א מיטוכונדריאלי מקודד tRNAs, rRNAs, ומספר polypeptides מיטוכונדרימי חיוני. נוקלאונואידים מיטוכונדרילי לחלק ולהפיץ בתוך רשת מיטוכונדריאלי דינמית העוברת ביקוע/פיוז’ן ושינויים מורפולוגיים אחרים. ברזולוציה גבוהה לחיות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא טכניקה פשוטה לאפיון העמדה והתנועה של נוקלאואיד. עבור טכניקה זו, הנוקלאואידים מסומנים בדרך כלל באמצעות תגי פלורסנט של רכיבי החלבון שלהם, כלומר שעתוק הגורם (TFAM). עם זאת, אסטרטגיה זו זקוקה לביטוי יתר של חלבון פלורסנט לבנות מתויג, אשר עשוי לגרום לפריטים (מדווחים על TFAM), והוא אינו אפשרי במקרים רבים. לצבעי ה-DNA האורגניים אין החסרונות הללו. עם זאת, הם תמיד להראות כתמים של DNAs הן גרעינית ומיטוכונדריאלי, ובכך חסר ספציפיות לנוקלאונואידים מיטוכונדרילי. על-ידי לקיחת בחשבון את התכונות פיזיקאלית-כימיות של צבעים כאלה, בחרנו הזרע חומצה גרעין כתם (SYBR Gold) והשיגה תיוג מועדף של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים. מאפייני הצבע, במיוחד הבהירות הגבוהה שלה על הכריכה ל-DNA, לאפשר כימות הבאים של תנועה נוקלאואיד מיטוכונדריאלי באמצעות סדרת זמן של תמונות תאורה מובנית ברזולוציה סופר.
Introduction
מעגלית 16.5 kbp מולקולות DNA להוות את החומר הגנטי של המיטו, קידוד 22 tRNAs, 2 rRNAs, ו -13 פוליפפטידים הדרושים למערכות זרחון חמצוני מיטוכונזילציה. דנ א מיטוכונדריאלי מאוגד מקדם תמלול מיטוכונדריאלי (tfam) וחלבונים אחרים מהווים את הנוקלאונואידים מיטוכונדריאידים1,2,3,4. נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים משנים את הפיזור בין המרכיבים של רשת מיטוכונדריאלי5,6 במהלך שיפוץ מורפולוגית שלה, ביקוע או היתוך בהתאם לשלב מחזור התא, מתח, וגורמים אחרים (נבדק בתוך pernas ואח ‘7). בנוסף, התנועה של נוקלאונואידים מיטוכונדרילי, הוא מעורב זאבת מערכתית מחלת אודם8 ועשוי לשחק תפקיד במחלות אחרות. מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית היא טכניקה פשוטה ללימודי תאים לחיים של אורגלים, אבל לטכניקה יש רזולוציה של > 200 ננומטר, שהוא גדול יותר מהגודל של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים (~ 100 nm9,10,11,12). מגבלה זו בוטלה על-ידי המכונה “טכניקות סופר-ברזולוציה”, כגון מחסור בפליטה מאולצת (הוהיסטד) ומיקרוסקופ בודד לוקליזציה של מולקולה (smlm)13,14. עד כה, נוקלאונואידים מדריאידים ו-DNAs אחרים היו מאופטים בתאים חיים על ידי מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישירה (Dnas)15. פיין מבנים תת מיטוכונדריאלי עם תנוחות הקשורות עם mtDNA נצפו על ידי סטד בתאים חיים16. עם זאת, אלה טכניקות סופר ברזולוציה דורשים עוצמת תאורה גבוהה, מה שגורם להשפעות פוטורעילות על תאים חיים17. לכן, פקיעה הזמן הדמיה של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה היא מאתגרת. כדי להתייחס לכך, השתמשנו במיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה סופר (SR-SIM)18. ה-SIM מחייב הרבה יותר כוח התאורה מ-סטד ו-SMLM19. יתר על כן, בניגוד לטכניקות הסטד ו smlm, ה-SIM מאפשר הדמיה פשוטה ססגוניות תלת מימדי (3d), וזה לא דורש מאפיינים פוטופיסיים מסוימים של fluorophores או מאגר הדמיה הרכב19.
האסטרטגיה המקובלת לתיוג נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים היא תיוג פלורסנט של חלבון נוקלאואיד מיטוכונדריאלי, כגון TFAM20. עם זאת, במקרים רבים, אסטרטגיה זו אינה מתאימה. יתר על כן, ביטוי יתר של חלבון פלורסנט-מתויג TFAM מייצרת חפץ רציני21. התוויות של דנ א עם צבעים אורגניים יש יתרונות מעל חלבון פלורסנט (FP) מבוססי אסטרטגיה. צבעים אורגניים הם ללא מגביל הקשורים לתיוג FP: הם יכולים לשמש עבור כל סוג של תאים או tissueand יכול להיות מיושם בכל נקודת זמן של ניסוי. הדמיה של תאים חיים של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים דווחה עם מספר צבעים מחייב DNA: dapi22, sybr ירוק23, וברנט דיקטקל24, ו picogreen15,25,26. חיסרון משמעותי של רוב DNA-מחייב צבעים עבור תיוג נוקלאואיד הוא שהם כתם כל ה-DNA בתוך התא. מיקוד לצבוע בלבד DNA מיטוכונדריאלי הוא רצוי מאוד. כדי להשיג את זה, בחירה זהירה של צבע בעל תכונות מתאימות פיזיקאלית-כימיות הוא הכרחי. צבעי ליפוהיפילית בעלי מטען חיובי מנוקד, כגון rhodamine 123, ידועים לצבור בחיים המיטופינים, אשר לשמר את הפוטנציאל הממברנה שלילית שלהם. בנוסף, צבע אידיאלי עבור תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים צריך לאגד דנ א עם זיקה גבוהה לפלוט פלואורסצנטית בהיר על כריכת ה-DNA. בהתחשב דרישות אלה, cyanines מסוימים הם מבטיחים (למשל, picogreen), אבל DNA גרעיני הוא מוכתם בשפע על ידי צבעים אלה בו עם דנ א מיטוכונדריאלי15,25,26. הפרוטוקול הנוכחי מתאר תיוג ספציפי של נוקלאונואידים מיטוכונדריאידים בתאים חיים עם צבע cyanine אחר, SYBR גולד (SG), ומעקב אחר הנוקלאונואידים בזמן לשגות סופר וידאו SIM ברזולוציה. יתר על כן, התאים לחיות SG ויטראז ניתן ליצור תמונה על ידי כל סוג של מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה (confocal וקד, מסתובב דיסק, epiפלואורסצנט, וכו ‘) מתאים לתאים חיים מצויד עם מקור אור ננומטר 488.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר רכיבים קריטיים לפרוטוקול: כדי להשיג תיוג מועדף של דנ א מיטוכונדריאלי, הריכוז של הצבע איגוד ה-DNA במהלך הדגירה צריך להישמר נמוך מאוד (למשל, 1:10000 דילול של מלאי מסחרי אופייני), ואת זמן הדגירה צריך להיות 30 דקות. זמן הדגירה צריך לעולם לא יעלה על 1 h. SYBR זהב צבע יש להשתמש; אחרים DNA-כריכת צבעים ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים באסיפא אקקטר ובאנג’ליקה ראמאולד (מכון מקס פלנק לביולוגיה חיסונית ואפיגנטיקה) לאספקת תאי הלה.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
