समय-चूक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी के लिए माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की विशिष्ट लेबलिंग
Summary
प्रोटोकॉल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए जेल दाग के साथ माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की विशिष्ट लेबलिंग, सुपर-रिज़ॉल्यूशन संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसआर-सिम) द्वारा लाइव लेबल कोशिकाओं की समय चूक श्रृंखला का अधिग्रहण, और न्यूक्लियोइड मोशन की स्वचालित ट्रैकिंग का वर्णन किया गया है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड प्रोटीन से लेपित माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए अणुओं द्वारा गठित कॉम्पैक्ट कण हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए टीआरएनए, आरएनआरए और कई आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल पॉलीपेप्टाइड्स को एन्कोड करता है। माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड डायनेमिक माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के भीतर विभाजित और वितरित करते हैं जो विखंडन/संलयन और अन्य रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरता है । हाई रेजोल्यूशन लाइव फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एक न्यूक्लॉयड की स्थिति और गति की विशेषता के लिए एक सीधी तकनीक है। इस तकनीक के लिए, न्यूक्लियोइड को आमतौर पर उनके प्रोटीन घटकों के फ्लोरोसेंट टैग के माध्यम से लेबल किया जाता है, अर्थात् प्रतिलेखन कारक एक (TFAM)। हालांकि, इस रणनीति को फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैग किए गए निर्माण की अतिअभिव्यक्ति की आवश्यकता है, जो कलाकृतियों (टीएफएएम के लिए रिपोर्ट) का कारण बन सकता है, और कई मामलों में संभव नहीं है। ऑर्गेनिक डीएनए बाइंडिंग रंगों से ये नुकसान नहीं होते। हालांकि, वे हमेशा परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डीएना दोनों का धुंधला दिखाते हैं, इस प्रकार माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स की विशिष्टता की कमी होती है। इस तरह के रंगों के भौतिक-रासायनिक गुणों को ध्यान में रखते हुए, हमने एक न्यूक्लिक एसिड जेल दाग (एसवाईबीआर गोल्ड) का चयन किया और लाइव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की तरजीही लेबलिंग हासिल की। रंग के गुण, विशेष रूप से डीएनए के लिए बाध्यकारी पर इसकी उच्च चमक, सुपर-रिज़ॉल्यूशन संरचित रोशनी छवियों की समय श्रृंखला का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड मोशन के बाद की मात्रा की अनुमति देते हैं।
Introduction
परिपत्र 16.5 केबीपी डीएनए अणु माइटोकॉन्ड्रिया की आनुवंशिक सामग्री, 22 टीआरएनए, 2 आरएनआरए और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन परिसरों के लिए आवश्यक 13 पॉलीपेप्टाइड का गठन करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए (टीएफएएम) और कई अन्य प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लॉइड1,,2,,3,,4बनाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स मूव और माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क5के घटकों के बीच पुनर्वितरितहोता है,6 इसके रूपात्मक रीमॉडलिंग, विखंडन या संलयन के दौरान सेल चक्र चरण, तनाव और अन्य कारकों के आधार पर (पर्नास एट अल7में समीक्षा की गई)। इसके अलावा माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की गति को सिस्टमिक ल्यूपस एरिथेटोस डिजीज8 में फंसाया जाता है और यह अन्य बीमारियों में भूमिका निभा सकता है । फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ऑर्गेनेल्स के लाइव-सेल अध्ययन के लिए एक सीधी तकनीक है, लेकिन तकनीक में >200 एनएम का एक संकल्प है, जो माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लिकॉइड (~ 100 एनएम9,,10,,11,,12)के आकार से बड़ा है। इस सीमा को तथाकथित “सुपर-रिज़ॉल्यूशन” तकनीकों द्वारा दरकिनार किया गया है, जैसे उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) और एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम)13,,14। अब तक, माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड ्स और अन्य डीएना को सीधे स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (DSTORM)15द्वारा लाइव कोशिकाओं में चित्रित किया गया था। एमटीडीएनए से संबंधित पदों के साथ ठीक उप-माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाएं लाइव कोशिकाओं16में एसटीईडी द्वारा देखी गईं। हालांकि, इन सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को उच्च रोशनी तीव्रता की आवश्यकता होती है, जो जीवित कोशिकाओं17पर फोटोटॉक्सिक प्रभाव का कारण बनती है। इसलिए, विवर्तन सीमा से परे संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की समय चूक इमेजिंग चुनौतीपूर्ण है। इसके समाधान के लिए हमने सुपर-रेजोल्यूशन स्ट्रक्चर्ड रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसआर-सिम)18का इस्तेमाल किया । सिम एसटीईडी और एसएमएलएम19की तुलना में एक बहुत कम रोशनी पावर डोज की आवश्यकता है . इसके अलावा, एसटीईडी और एसएमएलएम तकनीकों के विपरीत, सिम सीधे बहुरंगी त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग की अनुमति देता है, और इसमें फ्लोरोफोरस या इमेजिंग बफर संरचना19के विशेष फोटोभौतिक गुणों की आवश्यकता नहीं होती है।
लाइव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड लेबलिंग के लिए पारंपरिक रणनीतिटीएफएमएएम 20जैसे माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोड प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग है। हालांकि, कई मामलों में, यह रणनीति उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग टीएफएएम की अतिअभिव्यक्ति एक गंभीर विरूपण साक्ष्य21पैदा करती है। कार्बनिक रंगों के साथ डीएनए की लेबलिंग एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) आधारित रणनीति पर फायदे हैं । कार्बनिक रंग एफपी टैगिंग से संबंधित विवशों से मुक्त हैं: उनका उपयोग किसी भी प्रकार की कोशिकाओं या ऊतकों के लिए किया जा सकता है और किसी प्रयोग के किसी भी समय बीपर किया जा सकता है। मिटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड्स की लाइव सेल इमेजिंग की रिपोर्ट कई डीएनए-बाध्यकारी रंगों के साथ दी गई है: DAPI22,SYBR ग्रीन23,Vybrant DyeCycle24,और picoGreen15,,25,,26। न्यूक्लियोइड लेबलिंग के लिए सबसे डीएनए बाध्यकारी रंगों की एक पर्याप्त खामी यह है कि वे सेल के भीतर सभी डीएनए दाग । पूरी तरह से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के लिए एक रंग को लक्षित करना अत्यधिक वांछनीय है। इसे प्राप्त करने के लिए, उपयुक्त भौतिक-रासायनिक गुणों वाले एक डाया का सावधानीपूर्वक चयन आवश्यक है। लिपोफिलिक रंगों में स्थानीयकृत सकारात्मक आवेश, जैसे रोडामिन 123, लाइव माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होने के लिए जाना जाता है, जो उनकी नकारात्मक झिल्ली क्षमता को संरक्षित करता है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की विशिष्ट लेबलिंग के लिए एक आदर्श रंग डीएनए को उच्च आत्मीयता के साथ बांधना चाहिए और डीएनए बाध्यकारी पर उज्ज्वल फ्लोरेसेंस उत्सर्जित करना चाहिए। इन आवश्यकताओं को ध्यान में रखते हुए, कुछ साइनिन आशाजनक हैं (उदाहरण के लिए, पिकोग्रीन), लेकिन परमाणु डीएनए इन रंगों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए15,,25,,26के साथ बहुतायत से दाग दिया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में एक और साइनिन डाये, एसवाईबीआर गोल्ड (एसजी) के साथ लाइव कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोइड की विशिष्ट लेबलिंग और समय चूक सुपर-रेजोल्यूशन सिम वीडियो में नाभिककी की ट्रैकिंग का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, एसजी-दाग लाइव कोशिकाओं को किसी भी प्रकार के उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (कॉन्फोकल, कताई डिस्क, एपिफ्लोरसेंस, आदि) द्वारा चित्रित किया जा सकता है जो जीवित कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है और 488 एनएम प्रकाश स्रोत से लैस है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण घटक हैं: माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की तरजीही लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, इनक्यूबेशन के दौरान डीएनए बाध्यकारी रंगे की एकाग्रता को बहुत कम रखा जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, एक ठ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक वाघेला कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए आसिफा अख्तर और एंजेलिका रामबोल्ड (मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट फॉर इम्यूनोबायोलॉजी एंड एपिजेनेटिक्स) को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
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