Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse
Summary
Il protocollo descrive l’etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali con una macchia di gel di DNA disponibile in commercio, l’acquisizione di una serie di cellule con etichettatura live-lapse mediante microscopia di illuminazione strutturata super-risoluzione (SR-SIM) e tracciamento automatico del movimento nucleoide.
Abstract
I nucleotidi mitocondriali sono particelle compatte formate da molecole di DNA mitocondriale rivestite di proteine. Il DNA mitocondriale codifica tRNA, rRNA e diversi polipeptidi mitocondriali essenziali. I nucleoidi mitocondriali si dividono e si distribuiscono all’interno della rete mitocondriale dinamica che subisce fissione/fusione e altri cambiamenti morfologici. La microscopia a fluorescenza dal vivo ad alta risoluzione è una tecnica semplice per caratterizzare la posizione e il movimento di un nucleoide. Per questa tecnica, i nucleoidi sono comunemente etichettati attraverso tag fluorescenti dei loro componenti proteici, vale a dire il fattore di trascrizione a (TFAM). Tuttavia, questa strategia ha bisogno di sovraespressione di un costrutto fluorescente con tag proteico, che può causare artefatti (riportati per TFAM) e non è fattibile in molti casi. I coloranti organici che legano il DNA non presentano questi svantaggi. Tuttavia, mostrano sempre una colorazione dei DNA nucleari e mitocondriali, mancando quindi di specificità ai nucleoidi mitocondriali. Tenendo conto delle proprietà fisico-chimiche di tali coloranti, abbiamo selezionato una macchia di gel acido nucleico (SYBR Gold) e ottenuto l’etichettatura preferenziale dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive. Le proprietà del colorante, in particolare la sua elevata luminosità dopo il legame al DNA, permettono la successiva quantificazione del movimento nucleoideto mitocondriale utilizzando serie temporali di immagini di illuminazione strutturata super-risoluzione.
Introduction
Le molecole circolari di DNA da 16,5 kbp costituiscono il materiale genetico dei mitocondri, codificando 22 tRNA, 2 rRNA e 13 polipeptidi necessari per i complessi di fosforooostiami ossidriali mitocondriali. Il DNA mitocondriale legato al fattore trascrizione mitocondriale a (TFAM) e diverse altre proteine formano i nucleoidi mitocondriali1,2,3,4.4 I nucleoidi mitocondriali si spostano e si ridistribuiscono tra i componenti della rete mitocondriale5,6 durante il suo rimodellamento morfologico, fissione o fusione a seconda della fase del ciclo cellulare, dello stress e di altri fattori (rivisti in Pernas et al.7). Inoltre, il movimento dei nucleoidi mitocondriali, è implicato nellamalattia di 8 del lupus del lupus sistemico e può svolgere un ruolo in altre malattie. La microscopia a fluorescenza è una tecnica semplice per gli studi in cellule vive di organelli, ma la tecnica ha una risoluzione di >200 nm, che è maggiore delle dimensioni dei nucleoidi mitocondriali (100 nm9,10,11,12). Questo limite è stato aggirato con le cosiddette tecniche di “super-risoluzione”, come l’esaurimento stimolato delle emissioni (STED) e la microscopia per la localizzazione a singola molecola (SMLM)13,14. Finora, i nucleoidi mitocondriali e altri DNA sono stati immagini nelle cellule vive mediante microscopia ottica stocastica diretta (dSTORM)15. Strutture sub-mitocondriali fini con posizioni correlate con mtDNA sono state osservate da STED nelle cellule vive16. Tuttavia, queste tecniche di super-risoluzione richiedono un’elevata intensità di illuminazione, che provoca effetti fototossici sulle cellule viventi17. Pertanto, l’imaging time lapse di nucleoids mitocondriali con risoluzione oltre il limite di diffrazione è impegnativo. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato la microscopia di illuminazione strutturata a super-risoluzione (SR-SIM)18. SIM richiede una dose di potenza di illuminazione molto inferiore rispetto a STED e SMLM19. Inoltre, a differenza delle tecniche STED e SMLM, la SIM consente un semplice imaging tridimensionale multicolore (3D) e non richiede particolari proprietà fotofisiche dei fluorofori o della composizione del buffer di imaging19.
La strategia convenzionale per l’etichettatura dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive è l’etichettatura fluorescente di una proteina nucleoide mitocondriale, come TFAM20. Tuttavia, in molti casi, questa strategia non è adatta. Inoltre, la sovraespressione del TFAM fluorescente con tag proteici produce un grave artefatto21. L’etichettatura del DNA con coloranti organici presenta vantaggi rispetto a una strategia basata su proteine fluorescenti (FP). I coloranti organici sono privi di vincoli legati all’etichettatura fp: possono essere utilizzati per qualsiasi tipo di cellule o tessuti e possono essere applicati in qualsiasi momento di un esperimento. L’imaging cellulare vivo dei nucleoidi mitocondriali è stato segnalato con diversi coloranti leganti il DNA: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24e picoGreen15,25,26.26 Un sostanziale inconveniente della maggior parte dei coloranti che legano il DNA per l’etichettatura dei nucleoidi è che macchiano tutto il DNA all’interno della cellula. Puntare un tintura esclusivamente al DNA mitocondriale è altamente auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, è necessaria un’attenta selezione di un colorante che possiede proprietà fisico-chimiche adeguate. I coloranti lipofilici che possiedono una carica positiva delocalizzata, come la rhodamina 123, sono noti per accumularsi nei mitocondri vivi, che conservano il loro potenziale di membrana negativa. Inoltre, un colorante ideale per l’etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali dovrebbe legare il DNA con un’alta affinità ed emettere fluorescenza luminosa durante il legame del DNA. Considerando questi requisiti, alcune cianine sono promettenti (ad esempio, picoGreen), ma il DNA nucleare è abbondantemente macchiato da questi coloranti contemporaneamente con DNA mitocondriale15,25,26. Il protocollo attuale descrive l’etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali nelle cellule vive con un altro colorante cianino, SYBR Gold (SG), e il monitoraggio dei nucleoidi nei video SIM a super-risoluzione time lapse. Inoltre, le cellule vive macchiate di SG possono essere immagini da qualsiasi tipo di microscopio fluorescente invertito (confocale, disco rotante, epifluorescenza, ecc.) adatto per le cellule viventi e dotato di una fonte di luce fluorescente invertita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi componenti critici per il protocollo: per ottenere un’etichettatura preferenziale del DNA mitocondriale, la concentrazione del tinaccio di legame del DNA durante l’incubazione dovrebbe essere mantenuta molto bassa (ad esempio, una diluizione di 1:10.000 di un tipico stock commerciale), e il tempo di incubazione dovrebbe essere di 30 min. Il tempo di incubazione non deve mai essere superiore a 1 h. si deve usare un tinrio d’oro SYBR; altri coloranti che legano il DNA non sono abbastanza luminosi da generar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono Asifa Akhtar e Angelika Rambold (sia Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) per la fornitura di cellule HeLa.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
