Spesifikk merking av mitokondrienukleoider for tidsforløp strukturert belysningsmikroskopi
Summary
Protokollen beskriver spesifikk merking av mitokondriekjerner med en kommersielt tilgjengelig DNA gel flekk, oppkjøp av tidsforløp serie av levende merkede celler ved superoppløselig strukturert belysning mikroskopi (SR-SIM), og automatisk sporing av nukleoid bevegelse.
Abstract
Mitokondriekjerner er kompakte partikler dannet av mitokondrie-DNA-molekyler belagt med proteiner. Mitokondrie-DNA koder tRNAs, rRNAs, og flere essensielle mitokondriepolypeptider. Mitokondriekjerner deler og distribuerer i det dynamiske mitokondrienettverket som gjennomgår fisjon/fusjon og andre morfologiske endringer. Høyoppløselig live fluorescensmikroskopi er en enkel teknikk for å karakterisere en nukleoids posisjon og bevegelse. For denne teknikken er nukleoider vanligvis merket gjennom fluorescerende koder for deres proteinkomponenter, nemlig transkripsjonsfaktor a (TFAM). Denne strategien trenger imidlertid overuttrykk av en fluorescerende proteinmerket konstruksjon, som kan forårsake artefakter (rapportert for TFAM), og er ikke mulig i mange tilfeller. Organiske DNA-bindende fargestoffer har ikke disse ulempene. Imidlertid viser de alltid farging av både kjernefysiske og mitokondrie-DNAer, og mangler dermed spesifisitet til mitokondriekjerner. Ved å ta hensyn til de fysikalske kjemiske egenskapene til slike fargestoffer, valgte vi en nukleinsyregelflekk (SYBR Gold) og oppnådde fortrinnsrett merking av mitokondrietalleroider i levende celler. Egenskapene til fargestoffet, spesielt den høye lysstyrken ved binding til DNA, tillater påfølgende kvantifisering av mitokondriekjernebevegelse ved hjelp av tidsserier av superoppløselige strukturerte belysningsbilder.
Introduction
Sirkulære 16,5 kbp DNA-molekyler utgjør det genetiske materialet av mitokondrier, koding av 22 tRNA-er, 2 rRNA-er og 13 polypeptider som trengs for mitokondrieoksidative fosforyleringskomplekser. Mitokondrie DNA bundet til mitokondrietranskripsjonsfaktor a (TFAM) og flere andre proteiner danner mitokondriekjernene1,,2,,3,4. Mitokondriekjerner beveger seg og omfordeler mellom komponentene i mitokondrienettverket5,6 under sin morfologiske remodeling, fisjon eller fusjon avhengig av cellesyklusfase, stress og andre faktorer (gjennomgått i Pernas et al.7). I tillegg er bevegelsen av mitokondriekjerner, innblandet i systemisk lupus erythematosus sykdom8 og kan spille en rolle i andre sykdommer. Fluorescensmikroskopi er en enkel teknikk for live-celle studier av organeller, men teknikken har en oppløsning på > 200 nm, som er større enn størrelsen på mitokondriekjerner (~ 100 nm9,10,11,12). Denne grensen har blitt omgått av såkalte “superoppløsning” teknikker, for eksempel stimulert utslipp uttømming (STED) og enkelt molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM)13,14. Så langt ble mitokondriekjerner og andre DNAer avbildet i levende celler ved direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (dSTORM)15. Fine sub-mitokondriestrukturer med posisjoner som korrelerer med mtDNA ble observert av STED i levende celler16. Imidlertid krever disse superoppløsningsteknikkene høy belysningsintensitet, noe som forårsaker fototoksiske effekter på levende celler17. Derfor er tidsforløp av mitokondriekjerner med oppløsning utover diffraksjonsgrensen utfordrende. For å løse dette brukte vi superoppløsning strukturert belysning mikroskopi (SR-SIM)18. SIM krever en mye lavere belysningseffektdose enn STED og SMLM19. Videre, i motsetning til STED og SMLM teknikker, sim tillater enkel flerfarget tredimensjonal (3D) bildebehandling, og det krever ikke spesielle fotofysiske egenskaper av fluorofore eller bildebuffer sammensetning19.
Den konvensjonelle strategien for merking av mitokondrietall i levende celler er fluorescerende merking av et mitokondriekjerneprotein, som TFAM20. Men i mange tilfeller er denne strategien ikke egnet. Videre produserer overuttrykk av fluorescerende protein-merket TFAM en alvorlig artefakt21. Merking av DNA med organiske fargestoffer har fordeler fremfor en fluorescerende protein (FP)-basert strategi. Organiske fargestoffer er fri for begrensninger knyttet til FP-merking: de kan brukes til alle typer celler eller vevog kan brukes når som helst i et eksperiment. Live celle avbildning av mitokondriekjerner er rapportert med flere DNA-bindende fargestoffer: DAPI22,SYBR Green23,Vybrant DyeCycle24, og picoGreen15,25,26. En betydelig ulempe med de fleste DNA-bindende fargestoffer for nukleoid merking er at de flekker alt DNA i cellen. Målretting av et fargestoff utelukkende til mitokondrie-DNA er svært ønskelig. For å oppnå det er det nødvendig med nøye valg av et fargestoff som har egnede fysikalske kjemiske egenskaper. Lipofile fargestoffer som har avlokalisert positiv ladning, som rhodamin 123, er kjent for å samle seg i levende mitokondrier, som bevarer deres negative membranpotensial. I tillegg bør et ideelt fargestoff for spesifikk merking av mitokondriekjerneoider binde DNA med høy affinitet og avgir lys fluorescens ved DNA-binding. Tatt i betraktning disse kravene, visse cyaniner er lovende (f.eks picoGreen), men kjernefysisk DNA er rikelig farget av disse fargestoffer samtidig med mitokondrie DNA15,25,26. Den nåværende protokollen beskriver spesifikk merking av mitokondriekjerneoider i levende celler med et annet cyaninefargestoff, SYBR Gold (SG), og sporing av nukleoider i tid forfaller superoppløselige SIM-videoer. Videre kan SG-fargede levende celler avbildes av alle typer inverterte fluorescerende mikroskop (confocal, spinning disk, epifluorescens, etc.) egnet for levende celler og utstyrt med en 488 nm lyskilde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere kritiske komponenter i protokollen: For å oppnå fortrinnsrett merking av mitokondrie DNA, konsentrasjonen av DNA bindende fargestoff under inkubasjon bør holdes svært lav (f.eks. en 1:10,000 fortynning av en typisk kommersiell lager), og inkubasjonstiden bør være 30 min. Inkubasjonstiden skal aldri overstige 1 t. SYBR Gold fargestoff bør brukes; andre DNA-bindende fargestoffer er ikke lyse nok til å generere et sterkt signal ved merking ved lav konsentrasjon.
Begrensningen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner Asifa Akhtar og Angelika Rambold (både Max Planck Institute for Immunobiology and Epigenetics) for å gi HeLa-celler.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
