Специфическая маркировка митохондриальных нуклеоидов для time-lapse Структурированная микроскопия освещения
Summary
Протокол описывает специфическую маркировку митохондриальных нуклеоидов с коммерчески доступным пятном геля ДНК, приобретение временной промежутки серии живых помеченных клеток с помощью сверх-разрешения структурированной иллюминаторной микроскопии (SR-SIM) и автоматическое отслеживание движения нуклеоидов.
Abstract
Митохондриальные нуклеоиды – это компактные частицы, образованные молекулами митохондриальной ДНК, покрытыми белками. Митохондриальная ДНК кодирует тРНК, рРНК и несколько основных митохондриальных полипептидов. Митохондриальные нуклеоиды делятся и распределяются в динамической митохондриальной сети, которая подвергается делению/слиянию и другим морфологическим изменениям. Высокое разрешение живой флуоресценции микроскопии является простой метод, чтобы охарактеризовать положение и движение нуклеоидов. Для этого метода, нуклеоиды обычно помечены через флуоресцентные метки их белковых компонентов, а именно транскрипционный фактор a (TFAM). Тем не менее, эта стратегия нуждается в переэкспрессии флуоресцентного белка помечены построить, что может привести к артефактов (сообщил и для TFAM), и не представляется возможным во многих случаях. Органические ДНК-связывающие красители не имеют этих недостатков. Тем не менее, они всегда показывают окрашивание как ядерных, так и митохондриальных ДНС, при этом не хватает специфичности митохондриальных нуклеоидов. Принимая во внимание физико-химические свойства таких красителей, мы выбрали пятно геля нуклеиновой кислоты (SYBR Gold) и добились преференциальной маркировки митохондриальных нуклетодов в живых клетках. Свойства красителя, в частности его высокая яркость при привязке к ДНК, позволяют последующую количественную оценку движения митохондриальных нуклеоидов с использованием временных рядов структурированных изображений освещения супер-разрешения.
Introduction
Циркулярные молекулы ДНК 16,5 кбит/с составляют генетический материал митохондрий, кодирующих 22 тРНК, 2 РНК и 13 полипептидов, необходимых для митохондриальных окислительных фосфорилированных комплексов. Митохондриальная ДНК связана с митохондриальным транскрипционным фактором а (TFAM) и несколькими другими белками, образующих митохондриальные нуклеоиды1,,2,,3,4. Митохондриальные нуклеоиды перемещаются и перераспределяются между компонентами митохондриальной сети5,,6 во время его морфологической реконструкции, деления или синтеза в зависимости от фазы клеточного цикла, стресса и других факторов (рассмотрено в Pernas et al.7). Кроме того, движение митохондриальных нуклеоидов, замешано в системной волчанке эритематосовой болезни8 и может играть определенную роль в других заболеваниях. Флуоресценция микроскопия является простой метод для живых клеток исследования органелл, но техника имеет разрешение йgt;200 нм, который больше, чем размер митохондриальных нуклеоидов (100 нм9,10,11,12). Этот предел был обойден так называемыми методами «суперразрешения», такими как стимулируемое истощение выбросов (STED) и микроскопия локализации одной молекулы (SMLM)13,14. До сих пор митохондриальные нуклеоиды и другие ДНК были изображены в живых клетках прямой стохастической оптической реконструкцией микроскопии (dSTORM)15. Тонкие субмитохондриальные структуры с позициями, коррелирующие с мтДНК, наблюдались STED в живых клетках16. Тем не менее, эти супер-разрешение методы требуют высокой интенсивности освещения, что вызывает фототоксическое воздействие на живые клетки17. Таким образом, промежуток времени изображения митохондриальных нуклеоидов с разрешением за пределы дифракции является сложной задачей. Для решения этой проблемы мы использовали сверхразрешение структурированной иллюминаторной микроскопии (SR-SIM)18. SIM требует гораздо более низкой дозы энергии освещения, чем STED и SMLM19. Кроме того, в отличие от методов STED и SMLM, SIM позволяет простой многоцветной трехмерной (3D) визуализации, и это не требует особых фотофизических свойств флюорофоров или изображения буфера состава19.
Традиционной стратегией маркировки митохондриальных нуклеоидов в живых клетках является флуоресцентная маркировка митохондриального нуклеоидного белка, такого как TFAM20. Однако во многих случаях эта стратегия не подходит. Кроме того, переэкспрессия флуоресцентного белка помечены TFAM производит серьезный артефакт21. Маркировка ДНК органическими красителями имеет преимущества по сравнению со стратегией на основе флуоресцентного белка (FP). Органические красители не имеют ограничений, связанных с пометкой FP: они могут быть использованы для любого типа клеток или тканей, которые могут быть применены в любой момент эксперимента. Изображения клеток живых клеток митохондриальных нуклеоидов было сообщено с несколькими ДНК-связывающих красителей: DAPI22, SYBR Зеленый23, Vybrant DyeCycle24, и picoGreen15,25,26. Существенным недостатком большинства ДНК-связывающих красителей для обозначения нуклеоидов является то, что они окрашивают всю ДНК в клетку. Ориентация на краситель исключительно на митохондриальную ДНК очень желательна. Для этого необходим тщательный отбор красителя, обладающего подходящими физико-химическими свойствами. Липобильные красители, обладающие делокализованным положительным зарядом, такие как родамин 123, как известно, накапливаются в живых митохондриях, которые сохраняют их отрицательный мембранный потенциал. Кроме того, идеальный краситель для специфической маркировки митохондриальных нуклеоидов должен связывать ДНК с высоким сродством и излучать яркую флуоресценцию при связывании ДНК. Учитывая эти требования, некоторые цианины являются перспективными (например, picoGreen), но ядерная ДНК обильно окрашенных этими красителей одновременно с митохондриальной ДНК15,25,26. Настоящий протокол описывает специфическую маркировку митохондриальных нуклеоидов в живых клетках другим цианиновой красителем, SYBR Gold (SG), и отслеживание нуклеоидов в промежуток времени супер-разрешение SIM-видео. Кроме того, Окрашенные SG живые клетки могут быть изображены любым типом перевернутого флуоресцентного микроскопа (конфокальный, вращающийся диск, эпифлюоресценция и т.д.), подходящих для живых клеток и оснащенных источником света 488 нм.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важнейших компонентов протокола: Для достижения преференциальной маркировки митохондриальной ДНК, концентрация ДНК связывающего красителя во время инкубации должна быть очень низкой (например, 1:10,000 разбавления типичного коммерческого запаса), а инкубационное время д?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают Асифу Ахтар и Анжелику Рамболд (оба Института иммунобиологии и эпигенетики Макса Планка) за предоставление клеток HeLa.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
