Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo
Summary
El protocolo describe el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales con una mancha de gel de ADN disponible comercialmente, la adquisición de la serie time lapse de células etiquetadas en vivo mediante microscopía de iluminación estructurada de superresor resolución (SR-SIM) y el seguimiento automático del movimiento nucleoide.
Abstract
Los nucleoides mitocondriales son partículas compactas formadas por moléculas de ADN mitocondrial recubiertas de proteínas. El ADN mitocondrial codifica los ARN, los ARN y varios polipéptidos mitocondriales esenciales. Los nucleoides mitocondriales se dividen y distribuyen dentro de la red mitocondrial dinámica que sufre fisión/fusión y otros cambios morfológicos. La microscopía de fluorescencia en vivo de alta resolución es una técnica sencilla para caracterizar la posición y el movimiento de un nucleoide. Para esta técnica, los nucleoides se etiquetan comúnmente a través de etiquetas fluorescentes de sus componentes proteicos, a saber, el factor de transcripción a (TFAM). Sin embargo, esta estrategia necesita sobreexpresión de una construcción etiquetada con proteínas fluorescentes, que puede causar artefactos (informados para TFAM) y no es factible en muchos casos. Los tintes orgánicos de unión al ADN no tienen estas desventajas. Sin embargo, siempre muestran manchas de ADN nucleares y mitocondriales, por lo que carecen de especificidad a los nucleoides mitocondriales. Al tener en cuenta las propiedades fisicoquímicas de estos tintes, seleccionamos una mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) y logramos el etiquetado preferencial de nucleoides mitocondriales en células vivas. Las propiedades del tinte, particularmente su alto brillo al unirse al ADN, permiten la cuantificación posterior del movimiento nucleocio mitocondrial utilizando series temporales de imágenes de iluminación estructurada de superresorción.
Introduction
Las moléculas circulares de ADN de 16,5 kbp constituyen el material genético de las mitocondrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs y 13 polipéptidos necesarios para los complejos de fosforilación oxidativa mitocondrial. ADN mitocondrial unido al factor de transcripción mitocondrial a (TFAM) y varias otras proteínas forman los nucleoides mitocondriales1,2,3,4. Los nucleoides mitocondriales se mueven y redistribuyen entre los componentes de la red mitocondrial5,6 durante su remodelación morfológica, fisión o fusión dependiendo de la fase del ciclo celular, el estrés y otros factores (revisados en Pernas et al.7). Además, el movimiento de los nucleoides mitocondriales, está implicado en la enfermedad eritemológica del lupus sistémico8 y puede desempeñar un papel en otras enfermedades. La microscopía de fluorescencia es una técnica sencilla para los estudios de células vivas de orgánulos, pero la técnica tiene una resolución de >200 nm, que es mayor que el tamaño de los nucleoides mitocondriales (100 nm9,10,11,12). Este límite ha sido eludido por las técnicas denominadas “superresolución”, como el agotamiento estimulado de las emisiones (STED) y la microscopía de localización de molécula única (SMLM)13,,14. Hasta ahora, los nucleoides mitocondriales y otros ADN fueron imageados en células vivas mediante microscopía directa de reconstrucción óptica estocástica (dSTORM)15. El STED observó estructuras submitocondriales finas con posiciones correlacionadas con el ADNs en células vivas16. Sin embargo, estas técnicas de super resolución requieren una alta intensidad de iluminación, lo que causa efectos fototóxicos en las células vivas17. Por lo tanto, la toma de imágenes de lapso de tiempo de nucleoides mitocondriales con resolución más allá del límite de difracción es un desafío. Para hacer frente a esto, utilizamos microscopía de iluminación estructurada de superror resolución (SR-SIM)18. SIM requiere una dosis de potencia de iluminación mucho menor que STED y SMLM19. Además, a diferencia de las técnicas STED y SMLM, SIM permite imágenes tridimensionales multicolores (3D) directas, y no requiere propiedades fotofísicas particulares de los fluoróforos ni de la composición del búfer de imágenes19.
La estrategia convencional para etiquetar nucleoides mitocondriales en células vivas es el etiquetado fluorescente de una proteína nucleoides mitocondrial, como TFAM20. Sin embargo, en muchos casos, esta estrategia no es adecuada. Además, la sobreexpresión de TFAM con etiqueta de proteína fluorescente produce un artefacto grave21. El etiquetado del ADN con tintes orgánicos tiene ventajas sobre una estrategia basada en proteínas fluorescentes (FP). Los tintes orgánicos están libres de restricciones relacionadas con el etiquetado de FP: se pueden utilizar para cualquier tipo de células o tejidos y se pueden aplicar en cualquier momento de un experimento. Se han notificado imágenes celulares vivas de nucleoides mitocondriales con varios tintes de unión al ADN: DAPI22,SYBR Green23,Vybrant DyeCycle24y picoGreen15,,25,,26. Un inconveniente sustancial de la mayoría de los tintes de unión al ADN para el etiquetado nucleoide es que manchan todo el ADN dentro de la célula. Dirigir un tinte únicamente al ADN mitocondrial es altamente deseable. Para lograrlo, es necesaria una cuidadosa selección de un tinte que posea propiedades fisicoquímicas adecuadas. Se sabe que los tintes lipofílicos que poseen carga positiva deslocalizada, como la rhodamine 123, se acumulan en las mitocondrias vivas, que preservan su potencial de membrana negativo. Además, un tinte ideal para el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales debe unir el ADN con alta afinidad y emitir fluorescencia brillante al unirse al ADN. Teniendo en cuenta estos requisitos, ciertas cianinas son prometedoras (por ejemplo, picoGreen), pero el ADN nuclear está abundantemente manchado por estos tintes simultáneamente con ADN mitocondrial15,,25,,26. El presente protocolo describe el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales en células vivas con otro tinte de cianina, SYBR Gold (SG), y el seguimiento de los nucleoides en videos SIM de superrescronidad de lapso de tiempo. Además, las células vivas teñidas de SG pueden ser imágenes por cualquier tipo de microscopio fluorescente invertido (confocal, disco giratorio, epifluorescencia, etc.) adecuado para células vivas y equipado con una fuente de luz de 488 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios componentes críticos en el protocolo: Para lograr el etiquetado preferencial del ADN mitocondrial, la concentración del tinte de unión al ADN durante la incubación debe mantenerse muy baja (por ejemplo, una dilución de 1:10.000 de un stock comercial típico), y el tiempo de incubación debe ser de 30 min. El tiempo de incubación nunca debe exceder 1 h. Se debe utilizar el tinte SYBR Gold; otros tintes de unión al ADN no son lo suficientemente brillantes como para generar una señal fuerte al etiquetarse…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a Asifa Akhtar y Angelika Rambold (Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética) por proporcionar células de HeLa.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
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