Specifik märkning av mitokondriella nukleoider för time-lapse strukturerad belysning mikroskopi
Summary
Protokollet beskriver specifika märkning av mitokondriell nukleoider med en kommersiellt tillgängliga DNA gel fläck, förvärv av time lapse serie levande märkta celler av super-upplösning strukturerad belysning mikroskopi (SR-SIM), och automatisk spårning av nukleoid rörelse.
Abstract
Mitokondriella nukleoider är kompakta partiklar som bildas av mitokondriella DNA-molekyler belagda med proteiner. Mitokondriellt DNA kodar tRNAs, rRNAs och flera viktiga mitokondriella polypeptider. Mitokondriella nukleoider dela upp och distribuera inom den dynamiska mitokondriellt nätverk som genomgår fission / fusion och andra morfologiska förändringar. Högupplöst levande fluorescensmikroskopi är en enkel teknik för att karakterisera en nukleoid position och rörelse. För denna teknik, nukleoider är vanligen märkta genom fluorescerande taggar av deras proteinkomponenter, nämligen transkriptionsfaktor a (TFAM). Emellertid, denna strategi behöver överuttryck av en fluorescerande protein-taggade konstruktion, som kan orsaka artefakter (rapporteras för TFAM), och är inte möjligt i många fall. Organiska DNA-bindande färgämnen har inte dessa nackdelar. Men de visar alltid färgning av både nukleära och mitokondriella DNAs, vilket saknar specificitet till mitokondriella nukleoider. Genom att ta hänsyn till de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos sådana färgämnen, valde vi en nukleinsyra gel fläck (SYBR Gold) och uppnått förmånlig märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler. Egenskaper hos färgen, särskilt dess höga ljusstyrka vid bindning till DNA, tillåter efterföljande kvantifiering av mitokondriell nukleoid rörelse med hjälp av tidsserier av super-upplösning strukturerad belysning bilder.
Introduction
Cirkulär 16,5 kbp DNA-molekyler utgör det genetiska materialet i mitokondrierna, kodning 22 tRNAs, 2 rRNAs och 13 polypeptider som behövs för mitokondriellt oxidativa fosforylering komplex. Mitokondriellt DNA bundet till mitokondriell transkriptionsfaktor a (TFAM) och flera andra proteiner bildar mitokondriella nukleoider1,2,3,4. Mitokondriella nukleoider flyttar och omfördelar mellan komponenterna i mitokondriellt nätverk5,,6 under sin morfologiska ombyggnad, fission eller fusion beroende på cellcykelfas, stress och andra faktorer (ses över i Pernas et al.7). Dessutom är rörelsen av mitokondriella nukleoider, inblandad i systemisk lupus erythematosus sjukdom8 och kan spela en roll i andra sjukdomar. Fluorescensmikroskopi är en enkel teknik för levande cellstudier av organeller, men tekniken har en upplösning på >200 nm, vilket är större än storleken på mitokondriella nukleoider (~100 nm9,10,11,12). Denna gräns har kringgåtts av så kallade “super-resolution” tekniker, såsom stimulerad utsläpp utarmning (STED) och enda molekyllokalisering mikroskopi (SMLM)13,14. Hittills har mitokondriella nukleoider och andra DNA avbildas i levande celler av direkt stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM)15. Fina submitokondriella strukturer med positioner som korrelerar med mtDNA observerades av STED i levande celler16. Dessa superupplösningstekniker kräver dock hög belysningsintensitet, vilket orsakar fototoxiska effekter på levande celler17. Därför är time lapse imaging av mitokondriella nukleoider med upplösning bortom diffraktion gränsen utmanande. För att åtgärda detta använde vi superupplösningsstrukturerad belysningsmikroskopi (SR-SIM)18. SIM kräver en mycket lägre belysning effekt dos än STED och SMLM19. Dessutom tillåter SIM, i motsats till STED- och SMLM-tekniker, enkel tredimensionell (3D) bildbehandling med flera färger, och det kräver inte särskilda fotofysiska egenskaper hos fluoroforeerna eller bildbuffertkompositionen19.
Den konventionella strategin för märkning mitokondriell nukleoider i levande celler är fluorescerande märkning av ett mitokondriellt nukleoidprotein, såsom TFAM20. I många fall är dock denna strategi inte lämplig. Dessutom ger överuttryck av fluorescerande protein-märktA TFAM en allvarlig artefakt21. Märkning av DNA med organiska färgämnen har fördelar jämfört med en fluorescerande protein (FP)-baserad strategi. Organiska färgämnen är fria från begränsningar relaterade till FP-märkning: de kan användas för alla typer av celler eller vävnader och kan tillämpas när som helst i ett experiment. Live cell imaging av mitokondriellt nukleoider har rapporterats med flera DNA-bindande färgämnen: DAPI22, SYBR Green23, Vybrant DyeCycle24, och picoGreen15,25,26. En betydande nackdel med de flesta DNA-bindande färgämnen för nukleoid märkning är att de färga alla DNA i cellen. Inriktning ett färgämne enbart till mitokondriellt DNA är mycket önskvärt. För att uppnå detta är noggrant urval av ett färgämne som har lämpliga fysikalisk-kemiska egenskaper nödvändigt. Lipofila färgämnen som har delocalized positiv laddning, såsom rhodamin 123, är kända för att ackumuleras i levande mitokondrierna, som bevarar deras negativa membran potential. Dessutom bör ett idealiskt färgämne för specifik märkning av mitokondriella nukleoider binda DNA med hög affinitet och avge ljus fluorescens på DNA-bindning. Med tanke på dessa krav är vissa cyaniner lovande (t.ex. picoGreen), men kärn-DNA färgas rikligt av dessa färgämnen samtidigt med mitokondriellt DNA15,25,26. Det nuvarande protokollet beskriver specifika märkning av mitokondriella nukleoider i levande celler med en annan cyanin färgämne, SYBR Gold (SG), och spårning av nukleoider i tid förfaller super-upplösning SIM videor. Dessutom kan SG-färgade levande celler avbildas av alla typer av inverterad fluorescerande mikroskop (konfokal, snurrande skiva, epifluorescens, etc.) lämplig för levande celler och utrustade med en 488 nm ljuskälla.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska komponenter till protokollet: För att uppnå förmånlig märkning av mitokondriellt DNA bör koncentrationen av DNA-bindningsfärgen under inkubationen hållas mycket låg (t.ex. en 1:10 000 utspädning av ett typiskt kommersiellt lager) och inkubationstiden bör vara 30 min. Inkubationstiden får aldrig överstiga 1 h. SYBR Guldfärgämne bör användas. andra DNA-bindande färgämnen är inte tillräckligt ljusa för att generera en stark signal vid märkning vid låg koncentration.
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Asifa Akhtar och Angelika Rambold (både Max Planck Institute for Immunobiology och Epigenetics) för att tillhandahålla HeLa celler.
Materials
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | multi-modal super-resolution microscope containing module for super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM) | |
| high glucose DMEM | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| ibidi 35-mm dish, glass bottom | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi 8-well microSlide, glass bottom | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | image porcessing and visualisation software package | |
| iXon 885 | Andor Technologies | EMCCD camera with back-illuminated sensor | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope with array detector | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | red live cell mitochondrial stain |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | far red live cell mitochondrial stain |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | cell permeant DNA stain |
| Plan Apochromat 100x/1.46 Oil objective | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | cell permeant DNA stain |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | image acquisition and processing software |
Referências
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al. Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A. Nature Communications. 3, 1013 (2012).
- Bogenhagen, D. F. Mitochondrial DNA nucleoid structure. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).
- Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions. Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).
- Tauber, J., et al. Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).
- Garrido, N., et al. Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Caielli, S., et al. Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus. Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).
- Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy. Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35 (2014).
- Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM. European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).
- Kukat, C., et al. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
- Kukat, C., Larsson, N. G. mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid. Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Benke, A., Manley, S. Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling. ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).
- Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Gustafsson, M. G., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging. Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).
- Brown, T. A., et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).
- Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells. Science. 353 (6296), aaf5549 (2016).
- Dellinger, M., Geze, M. Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).
- Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).
- Zurek-Biesiada, D., et al. Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution. Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).
- He, J. Y., et al. The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization. Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).
- Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining. Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).
- Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy. PLoS One. 13 (9), e0203956 (2018).
