Burada, canlı anestezize edilmiş yetişkin zebrafislerde elektrokardiyogram kaydetmek ve yorumlamak için güvenilir, minimal invazif ve uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz.
Yetişkin zebra balığı ve insanların elektrokardiyogram dalga formları oldukça benzerdir. Bu elektrokardiyogram benzerlikleri sadece insan kardiyak Elektrofizyoloji ve miyopatiler için bir araştırma modeli olarak değil, aynı zamanda potansiyel kardiyotoksisite için yüksek verimlilik ilaç taramasında bir vekil model olarak zebra balığı değerini artırmak QT uzaması gibi insanlar. Bu nedenle, Yetişkin zebra balığı için in vivo elektrokardiyografi, vazgeçilmez değilse, çapraz-kesit veya boyuna içinde vivo elektrofizyolojik karakterizasyon için gerekli olan bir elektrik fenotyping aracıdır. Ancak, çok sık, güvenilir, pratik ve uygun maliyetli bir kayıt yönteminin olmaması, bu in vivo tanılama aracının daha kolay erişilebilir hale gelmesini engelleyen önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada, tutarlı, güvenilir kayıtlar veren düşük bakım, uygun maliyetli ve kapsamlı bir sistem kullanarak yetişkin zebra balığı için in vivo elektrokardiyografi için pratik, basit bir yaklaşım tarif ediyoruz. Biz 12-18 ay yaş sağlıklı yetişkin erkek zebra balığı kullanarak protokol göstermektedir. Ayrıca elektrokardiyogram kayıt sürecinde veri doğruluğunu ve sağlamlığını sağlamak için kalite doğrulama için hızlı bir gerçek zamanlı yorumlama stratejisi sunuyoruz.
Zebra balığı (Danio rerio) kalp operculum ‘un ve pektoral burun arasındaki torasik boşluğa anteroventrally bulunur. Kalp, gümüş renkli perikarkadran kesesi içinde oldukça gevşek kapalı. Anatomik olarak, zebra balığı kalp dört-Chambered insan ve diğer memeli kalpleri onun küçük ölçeği nedeniyle farklıdır (100-kat insan kalbine göre daha az) ve iki-tek atriyum ve bir ventrikül oluşan daireli yapısı. Yine de, elektrokardiyogram (EKG) dalga formları ve her iki türün QT aralığı süresi oldukça benzerdir (Şekil 1). Buna göre, zebra balığı insan kalıtsal aritmileri1,2,3 eğitim için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır ve potansiyel insan kardiyotoksisite yüksek verim ilaç taraması için4,5 , QT uzaması gibi.
İnsan kalp hastalıklarının rutin olarak değerlendirilmesinde, 1903 yılında Einthoven tarafından icat edildikten sonra vücut yüzeyi EKG ‘SI en yaygın olarak kullanılan ilk hat olmayan invaziv teşhis aracı haline gelmiştir. Buna karşılık, vücut-yüzey EKG kayıt yöntemi yetişkin zebra balığı için ilk adaptasyon beri 20066 ve birkaç değişiklik sonra7, bu teknik büyük ölçüde rağmen alanında birçok araştırmacı için ulaşılamaz kalmıştır Bu hayvan modelinin popülaritesi. Yetişkin zebrafish için in vivo EKG sorgusu yapan diğer araştırmacılar için, operatörler arasında geniş varyasyonlar farklı çalışmalarda EKG bulgularında tutarsızlığa yol açtı. Yaygın nedenleri hantal ve pahalı özel cihazlar ve yazılım, düşük sinyal-gürültü oranı ve karışıklık elektrot yerleşimi ile ilgili, tüm daha fazla yetişkin zebra balığı EKG özellikleri ve eksik bir anlayış tarafından ağırlaştırılmış dahil temel doku mekanizmaları. Bu In vivo EKG elektrik fenotip canlı zebrafish tek teşhis aracı olduğu göz önüne alındığında, hassasiyet ve özgüllük, yeniden üretilebilirliği ve erişilebilirlik geliştirmek için standart bir yöntem için net bir ihtiyaç vardır.
Burada, zebra balığı in vivo elektrokardiyogramları kaydetmek ve yorumlamak için pratik, güvenilir ve onaylanmış bir yaklaşım sunuyoruz (Şekil 2). Frontal düzlemde tek bir Bipolar kurşun kullanarak, EKG dalga formları ve canlı anestezik sağlıklı vahşi tip AB yetişkin zebrafish aralığı süreleri değişiklikleri araştırdık.
Bu çalışmada gösterildiği gibi tek bir kurşun yoluyla yetişkin zebra balığı için in vivo EKG kaydederken, EKG kayıt sonuçlarının kalitesi ve geçerliliği ile ilgili bir dizi uyarı vardır. İlk olarak, uygun anestezik seçiminde ve minimal gerekli anestezi konsantrasyonu, derinlik ve süre belirlenmesi, hareket eserleri bastırmak için kritik ihtiyaç karşı anestezik kardiyotoksisiteleri dengelemek ve bir priori belirlenmesi bir hayatta kalma vs Terminal deneysel tasarım. Farklı ilaç sınıflarından birden fazla anestezik bir kombinasyonu sinerjik potens üzerinde büyük harf5,14 ve paralytikler 1,5 bireysel ajanlar dozu düşürmek için5 veya yönetmek daha yüksek indüksiyon dozunun ardından düşük bakım dozu tipik stratejilerdir. Ancak, ölüm de dahil olmak üzere iyi bilinen potansiyel kardiyorespiratuar toksisiteleri rağmen,8, tricaine hala en yaygın olarak kullanılan, en iyi kullanılabilir, ve sadece anestezik ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmış (FDA) zebra balığı için Anestezi. Tricaine yetişkin zebra balığı EKG kaydında ya tek bir ajan olarak ya da diğer anestezik veya paraliklerle kombinasyon halinde halk tarafından kullanılmıştır.
İkinci olarak, normal bir yetişkin zebra balığı EKG ‘si için dört doğrulama ölçütlerimizi kullanarak en azından sağlıklı normal zebra balığı için kurşun yerleştirme doğruluğu sağlanabilir. Burada önermiş olduğumuz dört Doğrulama ölçütü, son iki ölçüt birlikte R dalgasının polaritesi ve normal EKG ‘de T dalgasının5,7,15arasındaki temel uyumunu teyit eder. Bu R ve T dalga uyumu, zebra balığı ve Human16,17 normal EKG arasında, insan kalp için bir vekil olarak zebra balığı kalp modelinin klinik alaka düzeyine katkıda bulunan, ancak kritik, ancak eleştirel bir benzerlik Elektrofizyoloji. Ancak, birçok benign veya malign koşul dört doğrulama ölçütünü geçersiz kılabilir. Örneğin, R ve T dalga uyumu miyokardiyal iskemi7,15kaybolur. Miyokardiyal iskemi içinde R ve T dalgası uyumu bu kaybı zebra balığı ve insan EKG arasında bir başka çarpıcı benzerlik olan zebra balığı miyokard infarktüsü modelinin klinik alaka katkıda bulunur.
Son olarak, EKG analizinde standart bir uygulama öneriyoruz. Teknolojinin gelişmesiyle birlikte, EKG analiz yazılımı otomatik EKG yorumu oluşturabilir. Ancak, eğitimli insanların EKG kaydına giden ilgili klinik senaryoya dayalı olarak tüm ECG ‘Leri her zaman yeniden yorumlamasını ve doğrulayacağını şiddetle tavsiye ederiz. Sadece EKG analiz yazılımı tarafından otomatik yorumlamaya yönelik rutin aşırı güven, özellikle normal EKG türevleri, kardiyak patolojiler veya alt optimum kurşun yerleştirme varlığı konusunda tavsiye edilmez.
Bu çalışmada kısa EKG kayıt oturumları için minimal invaziv yöntem üzerinde duruluyor. Ancak, saat süren Terminal uzun süreli EKG kayıt oturumları için ihtiyaç duyulması durumunda, sürekli perfüzyon6ile yeterli oksijenasyon, hidrasyon ve anestezi sağlamak için değişiklikler gereklidir.
Ayrıca, sinyal-gürültü oranını en az üç yoldan biriyle geliştirin. Daha güçlü bir amplifikatör seçmek genellikle pahalı, Eğer pratik değil, seçenek. Ses iletken azaltmak için perikardial sac açılması makul bir, ancak invazif, kabul edilmiştir yaklaşımı7. Kurşun eksenini ana kardiyak eksenine paralel bir yönde hizalamak için stratejik kurşun yerleştirme (Şekil 4b) EKG voltaj sinyallerini maksimize eder, özellikle perikardiyotominin yokluğunda deneme ve hata gerektirebilir.
Burada sunulan yetişkin zebra balığı için in vivo EKG sorgulama yöntemi dört ana avantaj sunuyor. İlk olarak, minimal invaziv yaklaşımımız sadece elektrot ekleme gerektirir, ancak balık ölçeği kaldırılması veya torakotomi-perikardiyotomi gerektirmez. Bu nedenle, balıkların ağrılarını en aza indirerek, yaklaşımımız uzunlamasına hayatta kalma çalışmalarında tekrarlanan EKG sorgulamaları sağlar. İkinci olarak, anestezik balık hareketini yeterince bastırdığınızda, çalışmamızda in vivo EKG kayıt sistemi, gürültüsüz ham sinyallerle sürekli olarak tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı verir. Üçüncü olarak, burada önermekte olduğumuz dört ölçüte sahip kalite doğrulama, EKG veri alımının başlarında veri doğruluğu ve sağlamlığı sağlar ve operatöre bağımlı varyasyonları en aza indirir. Son olarak, özellikle, geçen doğrulama kriterimiz (normal T dalgası dik), zebra balığı normal EKG ‘nin önemli bir insan benzeri özelliği olan R dalgası ve T dalgasının uyumunu kapsar (Şekil 1).
Ancak, hala grup ve diğerleri tarafından yetişkin zebra balığı için geçerli in vivo EKG metodolojisi için dört büyük sınırlamalar var.
İlk olarak, konu işbirliği eksikliği, sınırlandırıcı kardiyorespiratuar toksisite sonuçları ile anestezi ihtiyacını gerektirir. In vivo EKG sorgusu için, insan hastalarının sedasyon gerektirmesine karşın, zebra balığı her zaman değişken kardiyorespiratuar toksisitlere neden olan anestezik veya paralittik gerektirir.
İkincisi, bağlı EKG ‘nin güvenliğini sağlama ihtiyacı, başka bir non-invaziv prosedürün invaziv değerini biraz yükseltir. İnsan epidermis elektrotlar bağlı çünkü insanların vücut yüzeyi EKG kayıt kurşun yerleştirme tamamen non-invazif, in vivo EKG kayıt zebra balığı için kurşun yerleştirme daha invaziv çünkü, en azından, çelik elektrotlar olmalıdır Balık kas içine güvenli ekleme için balık derisi delinme.
Son iki sınırlama, zebra balığı göğüs ve kalbin anatomik kısıtlamalarından kaynaklanıyor. Üçüncüsü, Yetişkin zebra balığı kalbin ufacık boyutu EKG yol sayısı bir şiddetli azalma gerektirir. İnsanlar kolayca standart bir EKG kaydında oniki yol barındırırken, Yetişkin zebra balığı genellikle sadece tek bir tek kutuplu veya bipolar kurşun barındırabilir. Tek bir EKG kurşun dallanma aynı anda üç P, R ve T dalgaları genlikleri optimize etmek için zorluk olduğunu. Bu nedenle, zebra balığı EKG sorguunda optimum ve doğru kurşun yerleştirme önemini abartamaz. Zebrafish ‘de, T dalgası benzersiz bir algılama zorluk sunar, çünkü genellikle bu üç dalgaların en küçüküdür. Bu nedenle, zebra balığı T dalga genliği genellikle daha büyük P ve R dalgaları üzerinde optimizasyon önceliği almalısınız.
Dördüncü olarak, R dalga genliğini maksimize etmek için zebra balığı ana kardiyak ekseninin belirlenmesi zor olabilir. Nedeni zebra balığı kalp onun gevşek perikardial kese içinde insan kalbine göre form-Fitting eldiven gibi perikardium içinde daha fazla hareket özgürlüğü vardır.
Genel olarak, bu sınırlamalar gelecekteki Yöntem inovasyonunu teşvik edecektir. 3D baskı ve deforme elektronik18gelişiyle, orada doğrudan kurşun implantasyonu bir gün uyanık, uyarı, yüzme zebra balığı bir ‘ kalp çorap ‘ kablosuz elektrot sensörleri kullanarak umut vardır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Institutes tarafından destekleniyordu R01 HL141452 TPN için. Adınstruments, açık erişim yayınının maliyetini ödemek etmek için cömert finansman sağladı ancak deneysel tasarım, veri edinme, bu çalışmanın veri analizinde ya da yayınlamadan önce herhangi bir yazıda herhangi bir rolü yoktu.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |