Isolatie van macrofaag subsets en stromale cellen van myocardiale monsters van mens en muis
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om verschillende subgroepen van macrofagen en andere niet-immuuncellen van mens en muis myocardium te isoleren door het voorbereiden van een enkelvoudige celsuspensie door enzymatische spijsvertering. Gating schema’s voor flow cytometrie gebaseerde identificatie en karakterisering van geïsoleerde macrofagen worden ook gepresenteerd.
Abstract
Macrofagen vertegenwoordigen de meest heterogene en overvloedige immuuncelpopulaties in het hart en zijn centraal in het aansturen van ontstekingen en reparatieve reacties na hart letsel. Hoe verschillende subgroepen van macrofagen de immuunresponsen na hart letsel indelen is een actief gebied van onderzoek. Hier gepresenteerd is een eenvoudig protocol dat ons lab routinematig uitvoert, voor de extractie van macrofagen uit muizen en menselijke myocardium specimens verkregen uit gezonde en zieke individuen. Kort, dit protocol omvat enzymatische vertering van hartweefsel voor het genereren van een enkelvoudige cel suspensie, gevolgd door antilichaam kleuring, en flow cytometrie. Deze techniek is geschikt voor functionele assays uitgevoerd op gesorteerde cellen, evenals bulk en single cell RNA sequencing. Een groot voordeel van dit protocol is de eenvoud, de minimale variatie van de dag tot de dag en de brede toepasbaarheid, waardoor macrofaag heterogeniteit kan worden onderzocht in verschillende Muismodellen en menselijke ziekte-entiteiten.
Introduction
Macrofagen vertegenwoordigen het meest overvloedige immuunceltype in het hart, en ze spelen een belangrijke rol bij het genereren van robuuste inflammatoire en reparatieve reacties na hart letsel1,2,3,4. Voorheen identificeerde onze groep twee belangrijke deelverzamelingen van macrofagen in het muriene hart, afgeleid van de verschillende ontwikkelings oorsprong5,6. In het algemeen kunnen verschillende populaties van weefsel Resident cardiale macrofaag subgroepen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van het celoppervlak van CCR2 (C-C motief Chemokine receptor 2). CCR2– macrofagen (celoppervlak expressie: CCR2–mhciilaag en CCR2–mhciihoog) zijn van embryonale oorsprong (primitieve en erytromyeloïde lijnen), in staat om zichzelf te verlengen, en vertegenwoordigen een dominante populatie onder homeostatische voorwaarden. Resident CCR2+ macrofagen zijn van definitieve hematopoietische oorsprong, worden onderhouden door werving van circulerende monocyten, en vertegenwoordigen een kleine populatie onder homeostatische voorwaarden. Functioneel, CCR2– macrofagen genereren minimale ontsteking en zijn van cruciaal belang voor coronaire ontwikkeling neonatale hart regeneratie5,7. Daarentegen, CCR2+ macrofagen initiëren robuuste inflammatoire reacties na cardiale beledigingen en bijdragen tot onderpand hartspier letsel, nadelige renovatie van de linker ventrikel, en hartfalen progressie8,9.
Onlangs hebben we aangetoond dat het menselijk myocardium ook twee afzonderlijke subsets van macrofagen bevat die op dezelfde manier worden geïdentificeerd als CCR2– of CCR2+8. Genexpressie en functionele analyses toonden aan dat humane CCR2– en CCR2+ macrofagen functioneel uiteenlopende deelverzamelingen vertegenwoordigen en FUNCTIONEEL analoog zijn aan CCR2– en CCR2+ macrofagen die in het hart van de muis worden aangetroffen. Human CCR2– macrofagen Express robuuste niveaus van groeifactoren, waaronder IGF1, Pdgf, CYR61 en HB-EGF. CCR2+ macrofagen zijn verrijkt in chemokines en cytokinen die ontstekingen bevorderen, zoals Il-1B, Il-6, CCL-2, CCL-7 en TNF-a. Gestimuleerd CCR2+ macrofagen afscheiden duidelijk hogere niveaus van de inflammatoire cytokine Interleukine-1β (Il-1β) in cultuur. Hoe deze subsets differentieel bijdragen aan weefselherstel en linker ventriculaire (LV) remodellering in het kader van hart letsel blijft een gebied van actief onderzoek.
Flow-cytometrie gebaseerde analyse van macrofaag heterogeniteit in de muis en menselijk hart vereist het verteren van het hartweefsel en het genereren van een enkelvoudige celsuspensie gevolgd door flowcytometrische analyse of celsortering voor verdere downstream processen zoals bulk RNA sequencing/single cell RNA sequencing of kweek de cellen voor functionele assays. Het oorspronkelijke protocol voor het maken van een eencellige suspensie van Murine Hearts werd voor het eerst gerapporteerd door Nahrendorf Group in Nahrendorf et al. 200710. Ons lab heeft het protocol aangepast en aangepast om macrofagen uit het menselijk myocardium te halen. Met behulp van hetzelfde protocol, maar met een kleine wijziging in kleuring en gating schema, kunnen CD45– stromale cellen uit het menselijk myocardium ook worden geoogst. Hier gepresenteerd, in tekst en video, is een protocol dat routinematig wordt uitgevoerd voor de extractie van macrofagen of stromale uit het menselijk myocardium.
Monsters van het hartweefsel worden verkregen van volwassen patiënten met gedilateerde cardiomyopathie (DCM: idiopathische of familiaire) of ischemische cardiomyopathie (ICM) die een linker ventriculaire hulpinrichting (LVAD) implantatie of harttransplantatie ondergaan. Explanted Hearts of LVAD cores zijn intravasculair geperfundeerd met koude zoutoplossing voorafgaand aan het starten van de spijsvertering procedure. Het is belangrijk op te merken dat “kwaliteit” van weefsel specimen bepaald in termen van de mate van littekenvorming of vetweefsel infiltratie kan grote invloed hebben op de opbrengst van macrofagen. Hart specimens met grote gebieden van littekens zullen veel lagere celopbrengst hebben en kunnen ernstige technische beperkingen inhouden wanneer gewenst downstream analysemethoden in vitro celculturing vereisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol maakt de extractie mogelijk van verschillende macrofaag subgroepen van humaan myocardium. Het protocol is eenvoudig en duurt 3 tot 4 uur om de eencellige suspensie klaar te maken voor FACS-analyse. Hoewel het protocol relatief eenvoudig is uit te voeren, zijn er bepaalde technische aspecten die moeten worden overwogen, waardoor de variabiliteit wordt beperkt. Ten eerste, werken in tijdige mode met menselijk weefsel is noodzakelijk voor een optimale levensvatbaarheid van de cel. Het is belangrijk om te houden…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd mogelijk gemaakt door financiering van het Children’s Discovery Institute van Washington University en St. Louis Children’s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Stichting van het Barnes-Jewish Hospital (8038-88) en de NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. wordt ondersteund door NIH K08 HL123519 en Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
Referências
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
