Isolierung von Makrophagen-Teilmengen und Stromalzellen von Menschlichen und Maus-Myokardproben
Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um verschiedene Teilmengen von Makrophagen und anderen nicht-immunen Zellen aus menschlichem und Mausmyokard zu isolieren, indem eine einzelzellige Suspension durch enzymatische Verdauung vorbereitet wird. Gating-Schemata für die Strömungszytometrie basierende Identifizierung und Charakterisierung isolierter Makrophagen werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Makrophagen stellen die heterogensten und reichlichsten Immunzellpopulationen im Herzen dar und sind von zentraler Bedeutung bei der Förderung von Entzündungen und reparativen Reaktionen nach Herzverletzungen. Wie verschiedene Teilmengen von Makrophagen die Immunantworten nach einer Herzverletzung orchestrieren, ist ein aktives Forschungsgebiet. Präsentiert hier ist ein einfaches Protokoll, das unser Labor routinemäßig durchführt, für die Extraktion von Makrophagen von Maus und menschlichen Myokardproben von gesunden und kranken Personen erhalten. Kurz gesagt beinhaltet dieses Protokoll die enzymatische Verdauung von Herzgewebe, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, gefolgt von Antikörperfärbung und Durchflusszytometrie. Diese Technik eignet sich für funktionelle Assays, die an sortierten Zellen durchgeführt werden, sowie für die Massen- und Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Ein großer Vorteil dieses Protokolls ist seine Einfachheit, minimale tägliche Variation und breite Anwendbarkeit, die die Untersuchung der Makrophagenheterogenität über verschiedene Mausmodelle und menschliche Krankheitsentitäten ermöglicht.
Introduction
Makrophagen stellen den häufigsten Immunzelltyp im Herzen dar und spielen eine wichtige Rolle bei der Erzeugung robuster entzündlicher und reparativer Reaktionen nach Einer Herzerkrankung1,2,3,4. Zuvor identifizierte unsere Gruppe zwei Hauptteile von Makrophagen im murinen Herz, die von unterschiedlichen Entwicklungsursprungsherden abgeleitet wurden5,6. Auf der Grundlage der Zelloberflächenexpression von CCR2 (C-C-Motiv Chemokinrezeptor 2) können im Großen und Ganzen unterschiedliche Populationen von geweberesidenten Kardialmakrophagen-Untergruppen identifiziert werden. CCR2– Makrophagen (Zelloberflächenexpression: CCR2–MHCIIniedrig und CCR2–MHCIIhoch) sind embryonalen Ursprungs (primitive und erythromyeloidale Linien), die sich selbst erneuern können und eine dominante Population unter omöostatischen Bedingungen darstellen. Resident CCR2+ Makrophagen sind definitiv hämatopoetischen Ursprungs, werden durch Rekrutierung aus zirkulierenden Monozyten aufrechterhalten und stellen eine kleine Population unter omöostatischen Bedingungen dar. Funktionell, CCR2– Makrophagen erzeugen minimale Entzündungen und sind entscheidend für die koronare Entwicklung neonatale Herzregeneration5,7. Im Gegensatz dazu initiieren CCR2+ Makrophagen robuste Entzündungsreaktionen nach Herzbeleidigungen und tragen zu Kollateralkardiomyozytenverletzungen, einer negativen Umgestaltung des linken Ventrikels und der Herzinsuffizienzprogression8,9bei.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass das humane Myokard auch zwei verschiedene Teilmengen von Makrophagen enthält, die entweder als CCR2– oder CCR2+8identifiziert wurden. Genexpression und funktionelle Analysen ergaben, dass menschliche CCR2– und CCR2+ Makrophagen funktionell divergierende Teilmengen darstellen und funktional analog zu CCR2sind – und CCR2+ Makrophagen im Mausherz. Human CCR2– Makrophagen drücken robuste Wachstumsfaktoren aus, einschließlich IGF1, PDGF, Cyr61 und HB-EGF. CCR2+ Makrophagen sind in Chemokine und Zytokine angereichert, die Entzündungen fördern, wie IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 und TNF-a. Stimulierte CCR2+ Makrophagen sekrese deutlich höhere Konzentrationen des entzündlichen Zytokininterleukin-1s (IL-1) in der Kultur ab. Wie diese Teilmengen differenziell zur Gewebereparatur und zur linksventrikulären (LV) Umgestaltung im Zusammenhang mit Herzverletzungen beitragen, bleibt ein Bereich aktiver Forschung.
Die strömungszytometriebasierte Analyse der Makrophagenheterogenität in der Maus und im menschlichen Herzen erfordert die Verdauung des Herzgewebes und die Erzeugung einer einzelzelligen Suspension, gefolgt von einer zytometrischen Durchflussanalyse oder Zellsortierung für weitere nachgelagerte Prozesse wie Massen-RNA-Sequenzierung/Einzelzell-RNA-Sequenzierung oder Kultivierung der Zellen für funktionelle Assays. Das ursprüngliche Protokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension aus murinen Herzen wurde zuerst von der Nahrendorf-Gruppe in Nahrendorf et al. 200710berichtet. Unser Labor hat das Protokoll angepasst und modifiziert, um Makrophagen aus dem menschlichen Myokard zu extrahieren. Mit dem gleichen Protokoll, aber mit leichten Modifikationen im Färbe- und Gatingschema, können auch CD45– Stromalzellen aus dem menschlichen Myokard geerntet werden. Hier, in Text und Video, wird ein Protokoll vorgestellt, das routinemäßig für die Extraktion von Makrophagen oder Stromal aus dem menschlichen Myokard durchgeführt wird.
Herzgewebeproben werden von erwachsenen Patienten mit erweiterter Kardiomyopathie (DCM: idiopathisch oder familiär) oder ischämischer Kardiomyopathie (ICM) gewonnen, die sich einer linksventrikulären Assist-Einrichtung (LVAD) implantation oder einer Herztransplantation unterziehen. Explantierte Herzen oder LVAD-Kerne werden vor Beginn des Verdauungsverfahrens intravaskulär mit kalter Saline durchdrungen. Es ist wichtig zu beachten, dass die “Qualität” der Gewebeprobe, die in Bezug auf den Grad der Narbenbildung oder der Infiltration von Fettgewebe bestimmt wird, die Ausbeute von Makrophagen stark beeinflussen kann. Herzproben mit großen Narbenflächen haben eine viel geringere Zellausbeute und können schwerwiegende technische Einschränkungen darstellen, wenn gewünschte nachgelagerte Analysemethoden eine In-vitro-Zellkultivierung erfordern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll ermöglicht die Extraktion verschiedener Makrophagen-Teilmengen aus humanem Myokard. Das Protokoll ist einfach und dauert 3 bis 4 Stunden, um einzellige Suspension bereit für FACS-Analyse vorzubereiten. Obwohl das Protokoll relativ einfach durchzuführen ist, gibt es einige technische Aspekte, die berücksichtigt werden müssen, die die Variabilität minimieren. Erstens ist eine zeitnahe Arbeit mit menschlichem Gewebe für eine optimale Zelllebensfähigkeit notwendig. Es ist wichtig, das Gewebe in kalter S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Möglich wurde dieses Projekt durch Fördermittel des Children es Discovery Institute der Washington University und des St. Louis Children es Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), der Foundation of Barnes-Jewish Hospital (8038-88) und des NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. wird von NIH K08 HL123519 und Burroughs Welcome Fund (1014782) unterstützt.
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
Referências
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