用于扫描电子显微镜的胚胎、蛋壳和真菌培养

Summary

在这里，我们提出了使用扫描电子显微镜（SEM）成像精细组织样本的详细处理方案。介绍了三种不同的处理方法，即六甲基二甲苯（HMDS）化学干燥、简单空气干燥和临界点干燥，分别用于制备硬质蛋壳、早期发育阶段的胚胎和真菌培养。

Abstract

虽然扫描电子显微镜（SEM）被广泛用于各种生物和非生物样品的超结构分析，但处理不同生物样本的方法涉及独特的实践。处理样品文献中描述的所有传统做法仍然能找到有用的应用，但样品制备中的细微变化可以改变图像质量，并引入伪影。因此，需要使用特定于所分析的组织类型的独特样品制备技术，以获得具有超结构分辨率的高质量图像。本研究的重点是为使用SEM成像胚胎、硬质蛋壳和真菌培养物提供最佳的样品制备方案。建议进行以下优化，为所研究的三种不同的精细生物样品提供良好的结果。必须使用较温和的固定剂，如4%甲醛或3%谷醛，然后与乙醇系列脱水。与直接取自琼脂板的培养物相比，通过滑动培养体获得的琼脂块上的真菌菌丝具有更好的超结构完整性。与临界点干燥相比，使用 HMDS 的胚胎的化学干燥无需引入表面张力伪影即可进行干燥。HMDS 可防止因收缩而导致的开裂，因为样品在干燥过程中易碎性较小。然而，对于真菌培养，与化学干燥相比，临界点干燥可提供可接受的图像质量。蛋壳可以成像，没有特殊的准备步骤，除了彻底清洗和空气干燥之前安装。根据每次试验获得的可接受的图像质量，对制备方法进行了标准化。

Introduction

扫描电子显微镜 （SEM） 超结构分析和细胞内成像补充光显微镜，用于原核生物、植物和动物的三维轮廓分析。SEM 的高空间分辨率使其成为可用于检查纳米到微米尺度的样品的微观结构特性的最通用和最强大的技术之一。干燥标本被解析为具有强烈细节的组成和地形结构，这为制定关于功能关系1、2、3的有效结论奠定了基础^{,4,5,6,7,8,9.}在解释生物标本的SEM图像时，区分原生结构和加工过程中产生的工件是一个很大的挑战。SEM通常在非常高的真空度下工作，以避免气体分子对样品10、11发出的初级、二级或背散射电子束的任何干扰。此外，生物材料由于其不良或非导电特性而易受辐射损伤。装载到SEM的样品必须完全干燥，没有任何有机污染物，以消除在高真空环境中任何可能的排气10，11。由于生物标本主要由水组成，因此需要额外的准备技术，以确保保留原生结构。

获得的决议基于针对试样类型和所利用的工具参数优化制备方法。因此，有必要避免对所有组织类型使用通用处理步骤。一些生物标本需要较不严格的处理来保存其结构，而对精细类型的样品可能需要更多的时间和护理，以避免引入干燥伪影，如收缩和坍塌。样品制备是SEM成像的关键步骤;形态学研究的结果受到标本制备程序12、13的显著影响。许多生物样品的常见制备步骤是固定、脱水和涂上金属（如金、铂或铂金），以将其表面转化为导电性，用于 SEM 分析。使用的步骤的性质和组合将因组织类型和研究的具体目标而异。电荷积聚、对真空和电子束损伤的敏感性在加工柔软细腻的生物样品时会造成问题，因此需要额外的处理步骤来保留物体的原生结构。使用传统方法，如四氧化二氮固定，脱水导致收缩和脆弱的组织崩溃14，15，16，17。研究的目的是建立优雅的方法，通过将早期研究的想法与修改相结合，制备和形象软细腻组织（例如，爬行动物胚胎、画龟蛋壳和真菌培养）。

选择合适的固定方法是生物标本微观分析的第一步。从有机体分离后立即修复组织对于防止其形态因分解而改变至关重要。有效的固定剂应通过快速渗透细胞并不可逆转地保持效果来终止细胞过程，以稳定样品的结构，以承受 SEM¹⁷下的后续处理步骤和检查^,18.虽然已知几种化学和物理固定方法，但化学固定更常用于生物标本，以避免由于自干、再反应和干燥效应而发生任何细胞变化。文献中讨论了许多固定化学^{制剂，第17、19、20、21、22、23，}修复剂通过变性和凝固生物大分子，以及那些通过共价交联大分子修复的分子。酒精被用作变性固定剂，保持超细结构很差，主要用于光显微镜，不推荐用于电子显微分析。甲醛、谷醛和四氧化二氮等交联固定剂在组织内的大分子之间产生分子间和分子内交联，为超结构提供出色的保存^{11 ，24，25，26}.生物样品对温度敏感。建议固定开始时的温度为4°C，以降低膜蛋白的横向流动性，减缓细胞间分子的扩散，减缓固定^速度11。固定组织所需的时间很大程度上取决于样品的大小和固定剂扩散和与标本组件发生反应的速度。在4°C的PBS中一夜之间固定4%的甲醛或3%谷醛，是本研究中使用的试样SEM分析的首选方法，其顺序渗透特性允许处理较小的精细样品^{17,18,19,20,27.}消除四氧化二氮的固定后步骤，不仅由于其毒性，而且发现没有实现任何额外的优势，以提高图像质量的样本在本研究中分析。

生物样本含有干扰SEM操作的液体;因此，在将样品插入SEM样品室之前，需要干燥。一旦确保脱水，溶剂必须从组织中取出，而不会由于表面张力/干燥而使伪影进入标本。在SEM成像的处理组织中，常用三种不同的干燥方法：空气干燥、临界点干燥和冷冻干燥样品28、29、30、31。很少有研究报告所有三种干燥方法产生相同的结果与动物组织样本28，29，30，31。用于较小标本的一般做法是通过酒精和六甲基二甲苯（HMDS）的浓度上升系列进行化学脱水，但较大的样品使用临界点干燥（CPD）^仪器32进行干燥。在干燥过程中，通过液体/气体界面通过试样的小腔中形成相当大的力;这甚至会导致空心结构完全^坍塌33。由于处理而发生的任何变形都可能被误认为是试样的原生结构特征。因此，应消除加工的广义现象，并针对每种组织进行标准化独特的干燥过程，特别是在分析精细组织标本时。

在使用上述所有工艺的各种组合进行的几项试验中，我们标准化了可用于三个精细组织的SEM分析的方法：爬行动物胚胎、画龟的蛋壳和真菌培养。发育生物学家和形态学家描述了代表性脊椎动物胚胎发育过程中的正常和异常形态形成。基因信号通路的研究取决于新结构的形态描述。为了避免在SEM分析期间脊椎动物胚胎结构发生突变，我们建议在脱水后进行化学干燥。使用HMDS的化学干燥是比较最新的干燥方法，其优点包括相对快速、易用、成本损失、^{专业知识和设备}有限等。CPD 是一种常用的干燥技术，在特定温度和压力下在试样上使用传交 CO 2。我们确定HMDS适合干燥软细腻组织，并允许处理较大的样品，与临界点干燥相比，这给胚胎组织造成了广泛的变形。已采用多种方法制备SEM成像样本，以研究^真菌34的形态特征。真菌标本通常固定在四氧化二氮中，然后是乙醇脱水和临界点干燥，这可能提供令人满意的结果，尽管四氧化二氮的毒性作用^{是六、七、三}五在加工过程中改变溶液时，真菌材料的流失是明显的缺点。使用无固定性空气干燥的样品制备技术也已经实践^了36种，但会导致结构收缩和坍塌，在描述物种特征时，对此类标本的观察很容易被误解。真菌性子宫在与液体接触时会失去完整性，可能无法恢复结构，无法进行均匀干燥。由于这种效果，冷冻干燥通常用于干燥软组织，如真菌菌丝。冷冻干燥适用于清洁材料，但任何盐或分泌物的存在将遮盖仅在 SEM 观察阶段才能识别的表面细节。我们将滑动培养方法与谷醛固定和临界点干燥相结合，从而产生完好的真菌水肿和孢子的结构细节。虽然CPD干燥导致胚胎收缩，但当它与谷醛固定相结合时，它导致保存完好的菌丝结构。蛋壳不仅对动物胚胎具有首要作用，而且具有机械稳定性、气体和水的渗透性，以及发育中的胚胎的钙储备。淡水龟蛋壳根据其结构被归类为”刚性”，由于它们的可得性，受到生物学家1、2、3、4的高度重视。^,5,6,7,37,38.

我们详细介绍了简单的方法，以方便检查蛋壳和壳膜的彩绘龟，可以应用于任何刚性蛋壳物种。根据生成的图像质量和减少的潜在伪影来评估制备方法。

Protocol

注：本研究中使用的彩绘海龟（Chrysemys picta）蛋是在2015年5月至6月的筑巢季节从纽约州Oswego的Rice Creek现场站收集的，并经纽约州环境部许可。保护（DEC）。 1. 用于SEM处理胚胎的化学干燥方法 在筑巢季节从野外收集海龟蛋。提前准备孵化室，由带盖子（L x W x H） 6.7 厘米 x 25.4 厘米 x 10.2 厘米的塑料盒制成，填充了用湿润的紫玉石和泥炭苔混合物制备的床上用品?…

Representative Results

图1显示了彩绘龟（Chrysemys picta）胚胎的扫描电子微图分析。在床上用品介质上收集和孵育的彩绘海龟蛋，在化学干燥后安装在铝根上，用于SEM成像（图1A-E）。阶段12胚胎的横向视图显示颅面结构;上颌突出延伸到下颌外，并限制在一个标记良好的鼻腔坑;还观察到5个咽喉拱门（图1F）。与分段体体体…

Discussion

在我们的研究中，测试了不同的固定剂、脱水和干燥方法，为SEM成像制备三种不同的精细生物样本：胚胎、蛋壳和真菌培养物。SEM 通常用于表面分析，因此固定渗透不太令人担心，但必须了解，固定性内部结构固定不良将导致向内收缩或/和曲面结构坍塌。较大的组织样本也应考虑延长固定时间，根据固定持续时间，多次更换固定溶液。由于固定剂和组织之间的主动相互作用，细胞的渗透特性将?…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy