Diskriminering och kartläggning av de primära och bearbetade Transkripterna i Mitokonskbaserade majs med hjälp av en cirkulär RT-PCR-baserad strategi
Summary
Vi presenterar en cirkulär RT-PCR-baserad strategi genom att kombinera cirkulär RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ‘ polyfosfatasbehandling, och Northern blot. Detta protokoll innehåller ett normaliserings steg för att minimera påverkan av instabil 5 ‘ trifosfat, och det är lämpligt för att diskriminera och kartlägga de primära och bearbetade transkriptioner stabilt ackumulerade i majs mitokondrier.
Abstract
I växternas mitokondrier har vissa steady-state-avskrifter 5 ‘ trifosfat som härrör från initiering av transkription (primära transkriptioner), medan de andra innehåller 5 ‘ monofosfat genererade post-transkriptionellt (bearbetade utskrifter). Att diskriminera mellan de två typerna av utskrifter, flera strategier har utvecklats, och de flesta av dem är beroende av närvaro/frånvaro av 5 ‘ trifosfat. Trifosfat i primär 5 ‘ Termini är dock instabilt, och det hindrar en tydlig diskriminering av de två typerna av utskrifter. För att systematiskt differentiera och kartlägga de primära och bearbetade transkriptioner stabilt ackumulerade i majs mitokonskernas, har vi utvecklat en cirkulär RT-PCR (cRT-PCR)-baserad strategi genom att kombinera cRT-PCR, RNA 5 “polyphoshpatase behandling, kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) och Northern blot. Som en förbättring, inkluderar denna strategi ett RNA normaliserings steg för att minimera påverkan av instabil 5 ‘ trifosfat.
I detta protokoll är det berikade mitokondriella RNA förbehandlat med RNA 5 ‘ polyfosfatas, som omvandlar 5 ‘ triphsophate till monofosfat. Efter circularization och omvänd Transkription, de två cDNAs som härrör från 5 ‘ polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade RNAs normaliseras av majs 26S mogna rRNA, som har en bearbetad 5 ‘ och är okänslig för 5 ‘ polyfosfatas. Efter normalisering diskrimineras de primära och bearbetade transkripterna genom att jämföra cRT-PCR-och RT-qPCR-produkter som erhålls från den behandlade och icke-behandlade RNAs. Avskriften Termini bestäms genom kloning och sekvensering av cRT-PCR-produkterna och verifieras sedan av Northern blot.
Genom att använda denna strategi har de flesta steady-state avskrifter i majs mitokon På grund av den komplicerade avskrift mönstret av vissa mitokondriella gener, några steady-state avskrifter inte differentieras och/eller kartläggas, även om de upptäcktes i en nordlig blot. Vi är inte säkra på om denna strategi är lämplig att diskriminera och kartlägga steady-state-avskrifter i andra växters mitokona eller i plastids.
Introduction
I växternas mitokonliker ackumuleras många mogna och föregångare rnas som flera isoformer, och de steady-state avskrifter kan delas in i två grupper baserat på skillnaden vid deras 5 ‘ slutar1,2,3, 4. De primära transkriptioner har 5 ‘ trifosfat ändar, som härrör från transkription initiering. Däremot har de bearbetade transkripterna 5 ‘ monofosfat som genererats genom post-transkriptionell bearbetning. Diskriminering och kartläggning av de två typerna av utskrifter är viktigt att riva upp de molekylära mekanismerna bakom transkription och avskrift mognad.
För att skilja mellan de primära och bearbetade transkriptioner i växternas mitokonbener har fyra viktiga strategier utvecklats. Den första strategin är att förbehandla den mitokondriella RNAs med tobaks syra pyrofosfatas (TAP), som omvandlar 5 ‘ trifosfat till monofosfat och gör det möjligt för primära avskrifter att cirkulariseras av RNA Ligase. Avskriften överflöd av Tap-behandlade och icke-behandlade RNA-prover jämförs sedan med snabb förstärkning av cDNA ändar (Race) eller cirkulär RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den andra strategin utarmas bearbetade utskrifter för det första från mitokondriell rnas med Terminator 5 ‘-fosfat beroende exonukleas (tex), och de primära avskrifter som lämnas sedan kartläggs med primer-förlängningsanalys5,6 . Den tredje strategin är att pre-Cap de primära avskrifter med guanylyl transferase, och sedan positionen av trifosfated 5 ‘ Termini bestäms av primer förlängning tillsammans med ribonukleas eller S1 Nuclease Protection Analysis7,8 ,9. Skiljer sig från de beroende på närvaron/frånvaron av 5 ‘ trifosfat, den fjärde strategin kombinerar in vitro-transkription, platsriktade mutagenes, och primer förlängnings analys för att karakterisera den förmodade initiativtagarna och bestämma transkription initiering platser8,10,11. Genom att använda dessa strategier har många primära och bearbetade avskrifter fastställts i växternas mitokona.
Emellertid, flera studier har rapporterat att 5 ‘ trifosfat av primära utskrifter var instabila, och de var lätt omvandlas till monofosfat av okänd anledning2,4,12,13. Detta problem hindrar en tydlig diskriminering av de två typerna av utskrifter genom att använda tekniker beroende på förekomst/frånvaro av 5 ‘ trifosfat, och tidigare ansträngningar för att systematiskt diskriminera mellan de primära och bearbetade avskrifter i växt mitokonbruen misslyckades2,12.
I detta protokoll kombinerar vi cRT-PCR, RNA 5 “polyfosfatasbehandling, RT-qPCR och Northern blot för att systematiskt särskilja de primära och bearbetade transkriptioner som stabilt ackumuleras i majs (Zea mays) Mitokonskernas (figur 1). cRT-PCR möjliggör samtidig kartläggning av 5 ‘ och 3 ‘ extremiteter av en RNA-molekyl, och den är oftast anpassad för att kartlägga avskrift Termini i växterna2,12,14,15. RNA 5 ‘ polyfosfatas kan ta bort två fosfater från trifosfated 5 ‘ Termini, vilket gör de primära avskrifter tillgängliga för själv-ligering av RNA Ligase. Tidigare studier visade att mogna 26S rRNA i majs hade bearbetat 5 ‘ Terminus, och det var okänsligt för RNA 5 ‘ polyfosfatas1,16. För att minimera påverkan av instabila trifosfat vid primär 5 ‘ Termini, den 5 ‘ polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade RNAs normaliseras av mogna 26S rRNA, och de primära och bearbetade utskrifter differentieras sedan genom att jämföra cRT-PCR-produkter som erhålls från de två RNA-proverna. CRT-PCR kartläggning och diskriminering resultat verifieras av Northern blot och RT-qPCR, respektive. Slutligen används alternativa primers för att förstärka de avskrifter som upptäckts i norra blot men inte av cRT-PCR. Genom att använda denna cRT-PCR-baserade strategi har de flesta steady-state-avskrifter i mitokonskbaserad majs differentierats och kartlagts1.
Protocol
Representative Results
Discussion
I en tidigare studie, total och mitokondriell RNAs från cellsuspension kultur Arabidopsis användes för att kartlägga mitokondriell avskrift Termini av CRT-PCR, och liknande resultat erhölls12. Emellertid, endast berikat mitokondriellt RNA användes för att kartlägga mitokondriella transkription Termini i många andra studier1,2,3,9. Vi fann att berikninge…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 31600250, Y.Z.), vetenskap och teknikprojekt i Guangzhou City (Grant nr 201804020015, H.N.), och Kinas jordbruks forsknings system (Grant No. BILAR-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
Referências
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
