Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi
Summary
Vi præsenterer en cirkulær RT-PCR-baseret strategi ved at kombinere cirkulær RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ‘ polyfosfatase-behandling og Northern blot. Denne protokol indeholder en normalisering skridt til at minimere indflydelsen af ustabile 5 ‘ trifosfat, og det er egnet til at diskriminere og kortlægge de primære og forarbejdede udskrifter stabilt akkumuleret i majs mitochondrion.
Abstract
I plante-mitokondrier har nogle Steady-State udskrifter 5 ‘ trifosfat afledt af transkriptionsinitiering (primære udskrifter), mens de andre indeholder 5 ‘ monophosphat genereret post-transkriptivt (forarbejdede transkriptioner). At diskriminere mellem de to typer af udskrifter, er flere strategier blevet udviklet, og de fleste af dem er afhængige af tilstedeværelse/fravær af 5 ‘ trifosfat. Trifosfat i primær 5 ‘ Termini er imidlertid ustabil, og det hindrer en klar diskrimination af de to typer udskrifter. Vi har udviklet en cirkulær RT-PCR (cRT-PCR)-baseret strategi ved at kombinere cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyfoshpatase-behandling, kvantitativ, for systematisk at differentiere og kort gøre de primære og forarbejdede transskriptioner, der er stabilt akkumuleret i majs mitochondrion. RT-PCR (RT-qPCR) og Northern blot. Som en forbedring omfatter denne strategi et RNA-normaliserings trin for at minimere indflydelsen fra ustabil 5 ‘ trifosfat.
I denne protokol er det berigede mitokondrielle RNA forbehandlet af RNA 5 ‘ polyfosfatase, som omdanner 5 ‘ triphsophad til monophosphat. Efter cirkularisering og reverse transskription, de to cDNAs afledt af 5 ‘ polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs er normaliseret med majs 26S modne rRNA, som har en forarbejdet 5 ‘ ende og er ufølsom over for 5 ‘ polyfosfatase. Efter normalisering diskrimineres de primære og forarbejdede udskrifter ved at sammenligne cRT-PCR-og RT-qPCR-produkter, der er fremstillet af de behandlede og ikke-behandlede RNAs. Transkriptionen Termini er bestemt ved kloning og sekvensering af cRT-PCR-produkterne og derefter verificeret af Northern blot.
Ved at bruge denne strategi, er de fleste Steady-State udskrifter i majs betyder blevet bestemt. På grund af den komplicerede afskrift mønster af nogle mitokondrie gener, et par Steady-State udskrifter blev ikke differentieret og/eller kortlagt, selv om de blev påvist i en Northern blot. Vi er ikke sikker på, om denne strategi er egnet til at diskriminere og kort de Steady-State udskrifter i andre plante mitokondrier eller i blødninger.
Introduction
I plante mitokondrier akkumuleres mange modne og forløbere RNAs som flere isoformer, og Steady-State udskrifter kan opdeles i to grupper baseret på forskellen på deres 5 ‘ Ends1,2,3, 4. De primære udskrifter har 5 ‘ trifosfat ender, som er afledt af transkription indledning. Derimod har de forarbejdede transskriptioner 5 ‘ monophosphat genereret ved post-transkriptional behandling. Diskrimination og kortlægning af de to typer af udskrifter er vigtigt at optrævle de molekylære mekanismer underliggende transskription og transkriptionen ende modning.
For at skelne mellem de primære og forarbejdede transskriptioner i plante mitokondrier er fire store strategier blevet udviklet. Den første strategi er at pre-behandle mitokondrie RNAs med tobak syre pyrofosfatase (TAP), som konverterer 5 ‘ trifosfat til monophosphat og gør det muligt for primære udskrifter at være cirkulariseret af RNA-Ligase. Afskriften af TAP-behandlede og ikke-behandlede RNA-prøver sammenlignes derefter ved hurtig forstærkning af cDNA-afslutninger (race) eller cirkulær RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den anden strategi, er forarbejdede udskrifter først udtømt fra mitokondrie RNAs bruger Terminator 5 ‘-fosfat-afhængige exonuclease (tex), og de primære udskrifter venstre er derefter kortlagt af primer Extension analyse5,6 . Den tredje strategi er at pre-Cap de primære udskrifter ved hjælp af bundne transferase, og derefter placeringen af triphosphated 5 ‘ Termini bestemmes af primer udvidelse sammen med ribonuklease eller S1 nuclease beskyttelse analyse7,8 ,9. Forskellig fra dem, afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ‘ trifosfat, den fjerde strategi kombinerer in vitro transskription, site-instrueret mutagenese, og primer forlængelse analyse til at karakterisere de formodede initiativtagere og bestemme transkriptionen startsteder8,10,11. Ved at bruge disse strategier, mange primære og forarbejdede udskrifter er blevet fastlagt i plante mitokondrier.
Men, flere undersøgelser har rapporteret, at 5 ‘ trifosfat af primære udskrifter var ustabile, og de var let omdannes til monophosphate for ukendt årsag2,4,12,13. Dette problem hindrer en klar diskrimination af de to typer af udskrifter ved hjælp af teknikker afhængigt af tilstedeværelsen/fraværet af 5 ‘ trifosfat, og tidligere bestræbelser på systematisk at diskriminere mellem de primære og forarbejdede udskrifter i plante mitokondrier mislykkedes2,12.
I denne protokol kombinerer vi cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyfosfatasebehandling, RT-qPCR og Northern blot for systematisk at skelne mellem de primære og de behandlede udskrifter, som er stabilt akkumuleret i majs (Zea mays) mitokondrion (figur 1). cRT-PCR tillader samtidig kortlægning af 5 ‘ og 3 ‘ ekstremiteter af et RNA-molekyle, og det er normalt tilpasset til at kortlægge transkriptionen Termini i planter2,12,14,15. RNA 5 ‘ polyfosfatase kan fjerne to phosphater fra triphosphated 5 ‘ Termini, hvilket gør de primære udskrifter tilgængelige for selv ligering af RNA-Ligase. Tidligere undersøgelser viste, at modne 26s rRNA i majs havde forarbejdet 5 ‘ Terminus, og det var ufølsom over for RNA 5 ‘ polyfosfatase1,16. For at minimere indflydelsen af ustabil trifosfat i primær 5 ‘ Termini, normaliseres de 5 ‘ polyfosfatase-behandlede og ikke-behandlede RNAs af modne 26s rRNA, og de primære og forarbejdede udskrifter differentieres derefter ved at sammenligne cRT-PCR-produkter fremstillet af de to RNA-prøver. Resultaterne af cRT-PCR-kortlægning og-diskrimination verificeres af henholdsvis Northern blot og RT-qPCR. Endelig anvendes alternative primere til at forstærke de udskrifter, der opdages i det nordlige blot, men ikke af cRT-PCR. Ved at bruge denne cRT-PCR-baserede strategi, er de fleste Steady-State udskrifter i majs betyder blevet differentieret og kortlagt1.
Protocol
Representative Results
Discussion
I en tidligere undersøgelse, samlede og mitokondrie RNAs fra cellesuspension kultur Arabidopsis blev brugt til at kort mitokondrie transkriptionen Termini af CRT-PCR, og lignende resultater blev opnået12. Men, kun beriget mitokondrie RNA blev brugt til at kort mitokondrie transkriptionen Termini i mange andre undersøgelser1,2,3,9. Vi fandt, at tilsætning af …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den nationale Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 31600250, Y.Z.), videnskab og teknologiprojekter i Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.), og det kinesiske Landbrugsforsknings system (Grant No. BILER-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
Referências
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
