Formålet med denne metode er at identificere kræft stamceller (CSC) i kræft cellelinjer og primære menneskelige tumor prøver med kugledannende protokol, på en robust måde, ved hjælp af funktionelle analyser og fænotypisk karakterisering med flow cytometri og vestlige Skamplet.
Kræft stamceller (CSC) er en lille befolkning med selvfornyelse og plasticitet, som er ansvarlige for tumorigenese, modstandsdygtighed over for behandling og tilbagevendende sygdom. Denne population kan identificeres ved overflademarkører, enzymatisk aktivitet og en funktionel profil. Disse tilgange i sig selv er begrænsede på grund af fænotypisk heterogenitet og CSC-plasticitet. Her opdaterer vi den sfæredannende protokol for at opnå CSC-sfærer fra brystkræft og gynækologiske kræftformer, vurdering af funktionelle egenskaber, CSC-markører og proteinudtryk. Kuglerne opnås med encellede såning ved lav tæthed i suspensionskulturen ved hjælp af et halvfast methylcellulosemedium for at undgå migration og aggregater. Denne rentable protokol kan bruges i kræft cellelinjer, men også i primære tumorer. Den tredimensionale ikke-tilhængere suspension kultur menes at efterligne tumor mikromiljø, især CSC-niche, suppleres med epidermal vækstfaktor og grundlæggende fibroblast vækstfaktor for at sikre CSC signalering. Med henblik på en robust identifikation af CSC foreslår vi en supplerende tilgang, der kombinerer funktionel og fænotypisk evaluering. Sphere-dannende kapacitet, selvfornyelse og sfære projektion område etablere CSC funktionelle egenskaber. Derudover omfatter karakterisering flow cytometri evaluering af markører, repræsenteret ved CD44+/ CD24– og CD133, og Vestlige blot, overvejer ALDH. Den præsenterede protokol blev også optimeret til primære tumorprøver, efter en prøve fordøjelsesprocedure, nyttig til translationel forskning.
Kræftpopulationer er heterogene, med celler præsenterer forskellige morfoologier, spredning og invasion kapacitet, på grund af differentiale genekspression. Blandt disse celler, en minoritetspopulation findes navngivne kræftceller (CSC)1, som har kapacitet til selvfornyelse, opsummerer heterogenitet en primær tumor niche og producerer afvigende differentiere stammænd, der ikke reagerer tilstrækkeligt på homøostatisk kontrol2. CSC egenskaber kan oversættes direkte i klinisk praksis, da foreningen med begivenheder, såsom tumorigenicity eller modstandsdygtighed over for kemoterapi3. Identifikationen af CSC kan føre til udvikling af målrettede behandlinger, der kan omfatte blokering af overflademarkører, fremme af CSC differentiering, blokering af CSC signalering pathway komponenter, niche ødelæggelse, og epigenetiske mekanismer4.
Isoleringen af CSC er udført i cellelinjer og i prøver af primære tumorer5,6,7,8. Den funktionelle profil, der er beskrevet for CSC omfatter klonenisk kapacitet, sidepopulation og tumorosfæredannelse9. CD44høj/ CD24lav fænotype har været konsekvent forbundet med bryst CSC, som har vist sig at være tumorigenic in vivo og har allerede været forbundet med epitel til mesenkymale overgang5,10. Høj ALDH aktivitet har også været forbundet med stængel og epitel til mesenkymale overgang (EMT) i flere typer af faste tumorer11. ALDH-udtryk har været forbundet med resistens over for kemoterapi og CSC-fænotype in vitro12,13,14,15,16. Flere andre markører har været knyttet til CSC egenskaber i forskellige typer af tumorer, såsom CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 og andre, som beskrevet i tabel 1.
Tumorkuglerne består af en tredimensionel model for studiet og udvidelsen af CSC. I denne model dyrkes cellesuspensionerne fra cellelinjer og fra blod- eller tumorprøver i et medium suppleret med vækstfaktorer, nemlig epidermal vækstfaktor (EGF) og grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF), uden fosterserum og under ikke-klæbende tilstande17. Hæmning af cellevedhæftning resulterer i død ved anoikis af differentierede celler18. Kugler er afledt af klonale vækst af en isoleret celle. Til dette formål fordeles cellerne ved lav tæthed for at undgå cellefusion og sammenlægning19. En anden strategi omfatter brugen af halvsolid methylcellulose20.
Den sfæredannende protokol vundet popularitet i CSC isolation og ekspansion, på grund af tid og omkostninger og tekniske, rentable og reproducerbare årsager21,22. På trods af nogle reserver på, i hvilket omfang kugledannelse afspejler CSC, er der en tilbøjelighed af stamceller til at vokse i ikke-klæbende forhold med den karakteristiske fænotype, som ligner den indfødte mikromiljø21. Ingen af de metoder til rådighed for isolering af CSC fra solide tumorer har fuldstændig effektivitet, fremhæver betydningen af at udvikle mere specifikke markører eller kombinationer af metoder og markører.
I denne protokol beskriver vi isolationen af CSC med protokollen om sfæredannelse med princippet om vækst i en celle under ikke-klæbende forhold og evnen til at producere en differentieret fænotype. En skematisk repræsentation af denne procedure er repræsenteret i figur 1. Vi beskriver også karakterisering med overflademarkører og ALDH udtryk for CSC, både for bryst og gynækologiske tumorceller linjer og prøver af primære tumorer.
Denne protokol detaljer en tilgang til at opnå tumorkugler fra kræft cellelinjer og primære menneskelige prøver. Tumorkugler er beriget i en underpopulation med stamcellelignende egenskaber36. Denne berigelse i CSC afhænger af levedygtigheden i et forankringsfrit miljø, mens differentierede celler er afhængige af vedhæftning til et substrat37. Som primær plating af tumorceller i en lav overholdelse miljø, der pålægger suspension ikke sikrer berigelse i CSC i sig…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af det portugisiske selskab af gynækologi gennem 2016 Research Prize og CIMAGO. Cnc. IBILI støttes gennem Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) og samfinansieres af FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, der er godkendt af CHUC’s Etiske Komité for Sundhed og af den portugisiske nationale databeskyttelseskommission, var kilden til endometrieprøver af patienter, der blev fulgt på institutionens gynækologitjeneste. Figur 1 blev produceret ved hjælp af Servier Medical Art, fås fra www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |