इस पद्धति का उद्देश्य कैंसर सेल लाइनों में कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) और क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल के साथ प्राथमिक मानव ट्यूमर के नमूनों की पहचान करना है, एक मजबूत तरीके से, प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी के साथ कार्यात्मक परख और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन का उपयोग करना ब्लॉट.
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) आत्म नवीकरण और प्लास्टिसिटी के साथ एक छोटी आबादी है जो ट्यूमर, उपचार के प्रतिरोध और आवर्ती रोग के लिए जिम्मेदार हैं । इस आबादी को सतह मार्कर, एंजाइमैटिक गतिविधि और एक कार्यात्मक प्रोफ़ाइल द्वारा पहचाना जा सकता है। फेनोटाइपिक विषमता और सीएससी प्लास्टिसिटी के कारण ये दृष्टिकोण सीमित हैं। यहां, हम स्तन और स्त्री रोग कैंसर से सीएससी क्षेत्रों को प्राप्त करने, कार्यात्मक गुणों, सीएससी मार्कर और प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए क्षेत्र-निर्माण प्रोटोकॉल को अपडेट करते हैं। क्षेत्रों को निलंबन संस्कृति में कम घनत्व पर एकल-सेल सीडिंग के साथ प्राप्त किया जाता है, जो प्रवास और समुचित से बचने के लिए अर्ध-ठोस मिथाइलसेल्यूलोज माध्यम का उपयोग करते हैं। इस लाभदायक प्रोटोकॉल कैंसर सेल लाइनों में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी प्राथमिक ट्यूमर में । त्रिआयामी गैर-अनुयायी निलंबन संस्कृति ने ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट, विशेष रूप से सीएससी-आला की नकल करने के लिए सोचा, सीएससी सिग्नलिंग सुनिश्चित करने के लिए एपिडर्मल विकास कारक और बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक के साथ पूरक है। सीएससी की मजबूत पहचान के लिए लक्ष्य, हम कार्यात्मक और फेनोटाइपिक मूल्यांकन के संयोजन, एक पूरक दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं। क्षेत्र बनाने की क्षमता, आत्म नवीकरण और क्षेत्र प्रक्षेपण क्षेत्र सीएससी कार्यात्मक गुणों की स्थापना करता है। इसके अतिरिक्त, लक्षण वर्णन मार्कर के प्रवाह साइटोमेट्री मूल्यांकन शामिल है, CD44+/CD24 द्वाराप्रतिनिधित्व-और CD133, और पश्चिमी दाग, ALDH पर विचार । प्रस्तुत प्रोटोकॉल को प्राथमिक ट्यूमर नमूनों के लिए भी अनुकूलित किया गया था, एक नमूना पाचन प्रक्रिया के बाद, अनुवाद अनुसंधान के लिए उपयोगी है।
कैंसर की आबादी विषम हैं, कोशिकाओं के साथ विभिन्न रूपात्मकता, प्रसार और आक्रमण क्षमता पेश, अंतर जीन अभिव्यक्ति के कारण । इन कोशिकाओं में, एक अल्पसंख्यक आबादी कैंसर स्टेम सेल (सीएससी)1नाम मौजूद है, जिसमें आत्म-नवीकरण की क्षमता है, प्राथमिक ट्यूमर आला की विषमता को फिर से तैयार करना और असाधारण रूप से विभेदक पैदा करना जो होम्योपैथिक नियंत्रण2को पर्याप्त रूप से प्रतिक्रिया नहीं देते हैं। सीएससी गुणों को सीधे नैदानिक अभ्यास में अनुवादित किया जा सकता है, घटनाओं के साथ सहयोग को देखते हुए, जैसे ट्यूमरयाट्रिकिटी या कीमोथेरेपी3के प्रतिरोध। सीएससी की पहचान लक्षित उपचारों के विकास का कारण बन सकती है जिसमें सतह मार्कर की रुकावट, सीएससी भेदभाव को बढ़ावा देना, सीएससी सिग्नलिंग पाथवे घटकों को अवरुद्ध करना, आला विनाश और एपिजेनेटिक तंत्रशामिलहो सकते हैं।
सीएससी का अलगाव कोशिकाओं की रेखाओं में और प्राथमिक ट्यूमर5,6,7,8के नमूनों में किया गया है । सीएससी के लिए वर्णित कार्यात्मक प्रोफ़ाइल में क्लोनोजेनिक क्षमता, साइड पॉपुलैरिटी और ट्यूमरोस्फीयर फॉर्मेशन9शामिल हैं। CD44उच्च/CD24कम फेनोटाइप लगातार स्तन सीएससी के साथ जुड़ा हुआ है, जो वीवो में ट्यूमरीजेनिक साबित हुआ है और पहले से ही मेसेनचिमल संक्रमण5,10के लिए एपिथेलियल के साथ जुड़ा हुआ है । उच्च ALDH गतिविधि भी स्टेमनेस और उपापिथेलियल से मेसेनचिमल संक्रमण (EMT) के लिए कई प्रकार के ठोस ट्यूमर11में जुड़ा हुआ है । एएलडीएच अभिव्यक्ति कीमोथेरेपी के प्रतिरोध और सीएससी फेनोटाइप इन विट्रो12, 13,14,15,16से जुड़ी हुई है . कई अन्य मार्कर को विभिन्न प्रकार के ट्यूमर में सीएससी गुणों से जोड़ा गया है, जैसे CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 और अन्य, जैसा कि तालिका 1में वर्णित है।
ट्यूमर स्फीयर में सीएससी के अध्ययन और विस्तार के लिए एक त्रि-आयामी मॉडल शामिल है। इस मॉडल में, सेल लाइनों से और रक्त या ट्यूमर के नमूनों से सेल निलंबन की खेती विकास कारकों के साथ पूरक माध्यम में की जाती है, अर्थात् एपिडर्मल विकास कारक (ईजीएफ) और बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफएफ), भ्रूण बोवाइन सीरम के बिना और गैर-अनुयायी स्थितियों में17। कोशिका आसंजन के अवरोध के परिणामस्वरूप विभेदित कोशिकाओं की एनोसिकिस से मृत्यु हो जातीहै । गोले एक अलग कोशिका के क्लोनल विकास से प्राप्त होते हैं। इस उद्देश्य के लिए, कोशिकाओं को कम घनत्व पर वितरित किया जाता है ताकि सेल संलयन और एकत्रीकरण19से बचा जा सके। एक अन्य रणनीति में सेमीसॉलिड मिथाइलसेल्यूलोस20का उपयोग शामिल है ।
क्षेत्र बनाने प्रोटोकॉल समय और लागत और तकनीकी, लाभदायक, और प्रजनन कारणों से सीएससी अलगाव और विस्तार में लोकप्रियता प्राप्तकी 21,22। किस हद तक क्षेत्र गठन सीएससी को दर्शाता है पर कुछ भंडारों के बावजूद, विशेषता फेनोटाइप के साथ गैर-अनुयायी परिस्थितियों में बढ़ने के लिए स्टेम कोशिकाओं की प्रवृत्ति है, जो देशी माइक्रोएनवायरमेंट21जैसा दिखता है। ठोस ट्यूमर से सीएससी के अलगाव के लिए उपलब्ध तरीकों में से कोई भी पूरी दक्षता नहीं है, जो अधिक विशिष्ट मार्कर या पद्धतियों और मार्कर के संयोजन ों को विकसित करने के महत्व को रेखांकित करता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम गैर-अनुयायी स्थितियों में एकल-कोशिका वृद्धि के सिद्धांत और विभेदित फेनोटाइप का उत्पादन करने की क्षमता के साथ, क्षेत्र-निर्माण प्रोटोकॉल के साथ सीएससी के अलगाव का विस्तार करते हैं। इस प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दर्शाया गया है । हम स्तन और स्त्री रोग ट्यूमर कोशिकाओं और प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों दोनों के लिए सीएससी के लिए सतह मार्कर और एएलडीएच अभिव्यक्ति के साथ लक्षण वर्णन का भी वर्णन करते हैं।
यह प्रोटोकॉल कैंसर सेल लाइनों और प्राथमिक मानव नमूनों से ट्यूमर स्फीयर प्राप्त करने के लिए एक दृष्टिकोण का विवरण देता है। ट्यूमर स्फीयर स्टेम सेल जैसे गुणों36के साथ एक उप-आबादी में समृद्ध होत?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को पुर्तगाली सोसायटी ऑफ स्त्री रोग द्वारा 2016 अनुसंधान पुरस्कार के माध्यम से और सिमागो द्वारा वित्त पोषित किया गया था। सीएनसी. IBILI विज्ञान और प्रौद्योगिकी, पुर्तगाल (UID/NEU/04539/2013) के लिए फाउंडेशन के माध्यम से समर्थित है, और सह FEDER द्वारा वित्त पोषित-प्रतिस्पर्धा (POCI-01-0145-FEDER-007440) । Coimbra अस्पताल और Universitary केंद्र (CHUC) ट्यूमर बैंक, स्वास्थ्य के लिए है CHUC नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित और पुर्तगाली राष्ट्रीय डेटा संरक्षण आयोग द्वारा, संस्था के स्त्री रोग सेवा में पीछा रोगियों के एंडोमेट्रियल नमूनों का स्रोत था । चित्रा 1 सर्वियरमेडिकल आर्ट का उपयोग करके उत्पादित किया गया था, जो www.servier.com से उपलब्ध है।
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |