Målet med denne metodikken er å identifisere kreftstamceller (CSC) i kreftcellelinjer og primære menneskelige tumorprøver med sfæredannende protokoll, på en robust måte, ved hjelp av funksjonelle analyser og fenotypisk karakterisering med flow cytometri og vestlig Blot.
Kreft stamceller (CSC) er en liten befolkning med selvfornyelse og plastisitet som er ansvarlig for tumorigenese, motstand mot behandling og tilbakevendende sykdom. Denne populasjonen kan identifiseres med overflatemarkører, enzymatisk aktivitet og en funksjonell profil. Disse tilnærmingene per se er begrenset, på grunn av fenotypisk heterogenitet og CSC plastisitet. Her oppdaterer vi sfæreformingsprotokollen for å få CSC-kuler fra bryst- og gynekologiske kreftformer, vurdere funksjonelle egenskaper, CSC-markører og proteinuttrykk. Kulene oppnås med encellede seeding ved lav tetthet i suspensjonskultur, ved hjelp av et halvsolid metylcellulosemedium for å unngå migrasjon og aggregater. Denne lønnsomme protokollen kan brukes i kreftcellelinjer, men også i primære svulster. Den tredimensjonale ikke-tilhenger suspensjon kultur antatt å etterligne tumor mikromiljøet, spesielt CSC-nisje, er supplert med epidermal vekstfaktor og grunnleggende fibroblast vekstfaktor for å sikre CSC signalering. Med sikte på robust identifisering av CSC foreslår vi en komplementær tilnærming, som kombinerer funksjonell og fenotypisk evaluering. Sfæredannende kapasitet, selvfornyelseog sfæreprojeksjonsområde etablerer CSC funksjonelle egenskaper. I tillegg består karakterisering av flytcytometri evaluering av markørene, representert ved CD44+/CD24– og CD133, og vestlig blot, vurderer ALDH. Den presenterte protokollen ble også optimalisert for primære tumorprøver, etter en prøvefordøyelsesprosedyre, nyttig for translasjonell forskning.
Kreftpopulasjoner er heterogene, med celler som presenterer forskjellige morfologer, spredning og invasjonskapasitet, på grunn av differensialgenuttrykk. Blant disse cellene finnes en minoritetspopulasjon kalt kreftstamceller (CSC)1, som har kapasitet til selvfornyelse, rekapitulere heterogeniteten til den primære tumornisjen og produserer avvikende differensierende forfedre som ikke reagerer tilstrekkelig på homeostatiske kontroller2. CSC egenskaper kan oversettes direkte i klinisk praksis, gitt foreningen med hendelser, som tumorigeniitet eller motstand mot kjemoterapi3. Identifisering av CSC kan føre til utvikling av målrettede terapier som kan omfatte blokkering av overflatemarkører, markedsføring av CSC-differensiering, blokkering av CSC-signalbanekomponenter, nisjeødeleggelse og epigenetiske mekanismer4.
Isoleringen av CSC er utført i cellelinjer og i prøver av primære svulster5,6,7,8. Den funksjonelle profilen som er beskrevet for CSC inkluderer klonogen kapasitet, sidepopulasjon og tumorosfæredannelse9. CD44høy/CD24lav fenotype har vært konsekvent forbundet med bryst CSC, som har vist seg å være tumorigen in vivo og har allerede vært forbundet med epitel til mesenchymal overgang5,10. Høy ALDH-aktivitet har også vært forbundet med stemness og epitel til mesenchymal overgang (EMT) i flere typer solide svulster11. ALDH uttrykk har vært forbundet med motstand mot kjemoterapi og csc fenotype in vitro12,13,14,15,16. Flere andre markører har vært knyttet til CSC egenskaper i ulike typer svulster, for eksempel CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 og andre, som beskrevet i tabell 1.
Tumorsfærene består av en tredimensjonal modell for studiet og utvidelse av CSC. I denne modellen dyrkes cellesuspensjonene fra cellelinjer og fra blod- eller tumorprøver i et medium supplert med vekstfaktorer, nemlig epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), uten føtal storfe serum og i ikke-tilhengerforhold17. Hemming av cellevedheft resulterer i død av anoikis av differensierte celler18. Kuler er avledet fra klonal vekst av en isolert celle. For dette formålet distribueres cellene med lav tetthet for å unngå cellefusjon og aggregasjon19. En annen strategi inkluderer bruk av semisolid metylcellulose20.
Den sfæredannende protokollen fikk popularitet i CSC isolasjon og ekspansjon, på grunn av tid og kostnader og tekniske, lønnsomme og reproduserbare grunner21,22. Til tross for noen reserver på omfanget av hvilken sfæredannelse gjenspeiler CSC, er det en tilbøyelighet til stamceller å vokse i ikke-overholdende forhold med den karakteristiske fenotypen, som ligner den opprinnelige mikromiljøet21. Ingen av metodene som er tilgjengelige for isolering av CSC fra solide svulster har fullstendig effektivitet, og fremhever viktigheten av å utvikle mer spesifikke markører eller kombinasjoner av metoder og markører.
I denne protokollen beskriver vi isoleringen av CSC med sfæredannende protokoll, med prinsippet om encellet vekst i ikke-etterfølgende forhold og evnen til å produsere en differensiert fenotype. En skjematisk representasjon av denne prosedyren er representert i figur 1. Vi beskriver også karakteriseringen med overflatemarkører og ALDH-uttrykk for CSC, både for bryst- og gynekologiske tumorceller linjer og prøver av primære svulster.
Denne protokollen beskriver en tilnærming for å få tumorsfærer fra kreftcellelinjer og primære menneskelige prøver. Tumorsfærer er beriket i en underpopulasjon med stamcellelignende egenskaper36. Denne berikelsen i CSC er avhengig av levedyktighet i et forankringsfritt miljø, mens differensierte celler er avhengige av vedhende til et substrat37. Som primær plating av tumorceller i et lavt etterlevelse miljø som pålegger suspensjon sikrer ikke berikelse i CSC per …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av Det portugisiske samfunnet for gynekologi gjennom forskningsprisen for 2016 og av CIMAGO. Cnc. IBILI støttes gjennom Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013), og medfinansiert av FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, godkjent av CHUCs etikkkomité for helse og av den portugisiske nasjonale databeskyttelseskommisjonen, var kilden til endometrieprøver av pasienter fulgt ved institusjonens gynekologitjeneste. Figur 1 ble produsert ved hjelp av Servier Medical Art, tilgjengelig fra www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |