Dit protocol beschrijft de bouw van een hybride Microdrive-array waarmee implantatie van negen onafhankelijk instelbare tetrodes en één instelbare opto-silicium sonde in twee hersengebieden in vrij bewegende muizen mogelijk is. Ook gedemonstreerd is een methode voor het veilig herstellen en hergebruiken van de opto-silicium sonde voor meerdere doeleinden.
Multi-regionale neurale registraties kunnen cruciale informatie bieden voor het begrijpen van de interacties tussen meerdere hersen regio’s met een fijne tijdschaal. Conventionele Microdrive-ontwerpen staan echter vaak slechts één type elektrode toe om te registreren vanuit één of meerdere regio’s, waardoor de opbrengst van enkelvoudige of diepte-profiel opnames wordt beperkt. Het beperkt ook vaak de mogelijkheid om elektrode opnames te combineren met optogenetische hulpmiddelen om het pad en/of celtype specifieke activiteit te targeten. Hier gepresenteerd is een hybride Microdrive array voor vrij bewegende muizen om de opbrengst te optimaliseren en een beschrijving van de fabricage en het hergebruik van de Microdrive-array. Het huidige ontwerp heeft negen tetrodes en één opto-silicium sonde in twee verschillende hersengebieden tegelijkertijd in vrij bewegende muizen. De tetrodes en de opto-silicium sonde zijn onafhankelijk instelbaar langs de dorsoventral as in de hersenen om de opbrengst van eenheid en oscillerende activiteiten te maximaliseren. Deze Microdrive-array bevat ook een set-up voor licht, bemiddelende optogenetische manipulatie om de regionale-of celtypespecifieke reacties en functies van neurale circuits met lange afstand te onderzoeken. Bovendien kan de opto-silicium sonde na elk experiment veilig worden teruggewonnen en hergebruikt. Omdat de Microdrive-array bestaat uit 3D-geprinte onderdelen, kan het ontwerp van micro drives eenvoudig worden aangepast voor verschillende instellingen. Eerst beschreven is het ontwerp van de Microdrive array en hoe de optische vezel te hechten aan een silicium sonde voor optogenetica experimenten, gevolgd door de fabricage van de Tetrode bundel en implantatie van de array in een muis brein. De opname van lokale veld potentialen en unit stekelige gecombineerd met optogenetische stimulatie tonen ook de haalbaarheid van de Microdrive array systeem in vrij bewegende muizen.
Het is cruciaal om te begrijpen hoe Neuronale activiteit cognitief proces ondersteunt, zoals leren en geheugen, door te onderzoeken hoe verschillende hersengebieden dynamisch met elkaar omgaan. Om de dynamiek van de neurale activiteit onderliggende cognitieve taken te verhelderden, is grootschalige extracellulaire elektrofysiologie uitgevoerd in vrij bewegende dieren met behulp van Microdrive arrays1,2,3, 4. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende soorten Microdrive-array ontwikkeld om elektroden in meerdere hersengebieden te implanteren voor ratten5,6,7,8 en muizen9, 10 , 11 , 12. niettemin, huidige Microdrive ontwerpen in het algemeen niet toestaan voor het gebruik van meerdere sonde types, dwingen onderzoekers om een enkele elektrode type met specifieke voordelen en beperkingen te kiezen. Tetrode arrays werken bijvoorbeeld goed voor dichtbevolkte hersengebieden zoals de dorsale Hippocampus Ca11,13, terwijl siliconen sondes een beter geometrisch profiel geven voor het bestuderen van anatomische verbindingen14 , 15.
Tetrodes en silicium sondes worden vaak gebruikt voor in vivo chronische opname, en elk heeft zijn eigen voor-en nadelen. Tetrodes hebben bewezen aanzienlijke voordelen te hebben in een betere isolatie van één eenheid dan enkelvoudige elektroden16,17, naast kosteneffectiviteit en mechanische stijfheid. Ze bieden ook hogere opbrengsten van activiteiten met één eenheid in combinatie met micro drives8,18,19,20. Het is essentieel om het aantal gelijktijdig opgenomen neuronen voor het begrijpen van de functie van neurale circuits21te verhogen. Er zijn bijvoorbeeld grote aantallen cellen nodig om kleine populaties van functioneel heterogene celtypen te onderzoeken, zoals tijdgerelateerde22 -of belonings codering23 -cellen. Er zijn veel hogere celaantallen nodig om de decoderings kwaliteit van Spike sequenties13,24,25te verbeteren.
Tetrodes hebben echter een nadeel bij het opnemen van ruimtelijk gedistribueerde cellen, zoals in de cortex of de thalamus. In tegenstelling tot tetrodes, silicium sondes kunnen ruimtelijke distributie en interactie van lokale veld potentialen (lfps) en stekelige activiteiten binnen een lokale structuur14,26bieden. Multi-schacht silicium sondes vergroten het aantal opnamelocaties verder en maken opname mogelijk in enkele of naburige structuren27. Echter, dergelijke arrays zijn minder flexibel in de positionering van elektrode-sites in vergelijking met tetrodes. Bovendien zijn complexe Spike-sorteer algoritmen vereist in hoge-dichtheids tests om informatie te extraheren over actiemogelijkheden van naburige kanalen om de gegevens te spiegelen die zijn verworven door tetrodes28,29,30. Vandaar dat de totale opbrengst van enkelvoudige eenheden vaak minder is dan tetrodes. Bovendien zijn silicium sondes nadelig vanwege hun broosheid en hoge kosten. Zo is de keuze van tetrodes vs. silicium sondes afhankelijk van het doel van de opname, wat een vraag is of het verkrijgen van een hoge opbrengst van enkelvoudige eenheden of ruimtelijke profilering op de opnamelocaties prioriteit krijgt.
Naast het opnemen van neurale activiteit, is optogenetische manipulatie uitgegroeid tot een van de krachtigere instrumenten in de neurowetenschappen om te onderzoeken hoe specifieke celtypen en/of trajecten bijdragen aan neurale circuit functies13,31, 32,33. Echter, optogenetische experimenten vereisen extra aandacht in Microdrive array ontwerp om de vezel connector te hechten aan stimulatie lichtbronnen34,35,36. Vaak is het aansluiten van Fiber-Optics een relatief grote kracht, wat kan leiden tot een mechanische verschuiving van de sonde in de hersenen. Daarom is het niet een triviale taak om een implanteerbare optische vezel te combineren met conventionele Microdrive-arrays.
Om bovengenoemde redenen zijn onderzoekers verplicht om de selectie van het type elektrode te optimaliseren of om een optische vezel te implanteren, afhankelijk van het doel van de opname. Tetrodes worden bijvoorbeeld gebruikt om een hogere eenheids opbrengst te bereiken in Hippocampus1,13, terwijl silicium sondes worden gebruikt om het laminaire diepte Profiel van corticale gebieden te onderzoeken, zoals de mediale entorhinale cortex (MEC)37. Op dit moment werden micro drives voor gelijktijdige implantatie van tetrodes en silicium sondes gerapporteerd voor ratten5,11. Het is echter zeer uitdagend om meerdere tetrodes en silicium sondes bij muizen te implanteren vanwege het gewicht van de micro drives, beperkte ruimte op de muis, en ruimtelijke vereisten voor het ontwerpen van de Microdrive om verschillende voelers te gebruiken. Hoewel het mogelijk is om silicium sondes zonder een Microdrive te implanteren, staat deze procedure niet toe dat de sonde wordt aangepast en wordt het slagingspercentage van het herstel van silicium sonde12,38lager. Bovendien, optogenetische experimenten vereisen aanvullende overwegingen in Microdrive array ontwerp. Dit protocol demonstreert het construeren en implanteren van een Microdrive array voor chronische opnames in vrij bewegende muizen, waardoor implantatie van negen onafhankelijk instelbare tetrodes en één instelbare opto-silicium sonde mogelijk is. Deze Microdrive-array vergemakkelijkt ook optogenetische experimenten en herstel van de silicium sonde.
Het protocol demonstreert het construeren en implanteren van een hybride Microdrive array die het mogelijk maakt om neurale activiteiten uit te voeren vanuit twee hersengebieden met behulp van onafhankelijke instelbare tetrodes en een silicium sonde in vrij gedragen muizen. Het toont ook optogenetische experimenten en het herstel van de silicium sonde na experimenten. Terwijl instelbare silicium sonde33 of opto-silicon probe36 implantatie eerder is aangetoond bij muizen, he…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd deels gesteund door Japan Society voor de promotie van Science Overseas Research Fellowships (HO), begiftigd geleerde programma (TK), Human Frontier Science Program (TK), Brain Research Foundation (TK), faculteits wetenschappen en technologie verwerving en Retentie programma (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), en door de Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Detective Research Grant (JY). Wij danken W. Marks voor waardevolle commentaren en suggesties tijdens de voorbereiding van het manuscript.
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |