Sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre
Summary
Este protocolo describe la construcción de una matriz híbrida de micromotores que permite la implantación de nueve tetrodios ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable en dos regiones cerebrales en ratones que se mueven libremente. También se ha demostrado un método para recuperar y reutilizar de forma segura la sonda de optosilicio para múltiples propósitos.
Abstract
Las grabaciones neuronales multirregionales pueden proporcionar información crucial para comprender las interacciones de escala de tiempo fino entre varias regiones cerebrales. Sin embargo, los diseños de microunidades convencionales a menudo solo permiten el uso de un tipo de electrodo para grabar desde una o varias regiones, lo que limita el rendimiento de grabaciones de una sola unidad o perfil de profundidad. También a menudo limita la capacidad de combinar grabaciones de electrodos con herramientas optogenéticas para apuntar a la vía y / o actividad específica del tipo de célula. Aquí se presenta una matriz de microunidades híbridas para ratones en movimiento libre para optimizar el rendimiento y una descripción de su fabricación y reutilización de la matriz de microunidades. El diseño actual emplea nueve tetrodes y una sonda de optosilicio implantada en dos áreas cerebrales diferentes simultáneamente en ratones que se mueven libremente. Los tetrodes y la sonda de optosilicio son ajustables independientemente a lo largo del eje dorsoventral en el cerebro para maximizar el rendimiento de las actividades unitarias y oscilatorias. Esta matriz de micromotores también incorpora una configuración para la manipulación optogenética ligera y mediadora para investigar las respuestas y funciones específicas del tipo regional o celular de los circuitos neuronales de largo alcance. Además, la sonda de optosilicio se puede recuperar y reutilizar de forma segura después de cada experimento. Debido a que la matriz de microunidades consta de piezas impresas en 3D, el diseño de microunidades se puede modificar fácilmente para adaptarse a varios ajustes. Se describe por primera vez el diseño de la matriz de micromotores y cómo conectar la fibra óptica a una sonda de silicio para experimentos de optogenética, seguido de la fabricación del paquete de tetrodes y la implantación de la matriz en un cerebro de ratón. El registro de los potenciales de campo locales y el pico de unidad combinado con la estimulación optogenética también demuestran la viabilidad del sistema de matriz de micromotores en ratones que se mueven libremente.
Introduction
Es crucial entender cómo la actividad neuronal apoya el proceso cognitivo, como el aprendizaje y la memoria, investigando cómo diferentes regiones cerebrales interactúan dinámicamente entre sí. Para esclarecer la dinámica de la actividad neuronal subyacente a las tareas cognitivas, se ha llevado a cabo electrofisiología extracelular a gran escala en animales en movimiento libre con la ayuda de matrices de micromotores1,2,3, 4. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios tipos de matriz demicromotores para implantar electrodos en múltiples regiones cerebrales para ratas 5,6,7,8 y ratones9, 10 , 11 , 12. Sin embargo, los diseños actuales de microunidades generalmente no permiten el uso de múltiples tipos de sonda, lo que obliga a los investigadores a elegir un solo tipo de electrodo con beneficios y limitaciones específicas. Por ejemplo, las matrices de tetrodes funcionan bien para regiones cerebrales densamente pobladas como el hipocampo dorsal CA11,13, mientras que las sondas de silicio dan un mejor perfil geométrico para el estudio de las conexiones anatómicas14 , 15.
Tetrodes y sondas de silicio se utilizan a menudo para la grabación crónica in vivo, y cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Se ha demostrado que los tetrodes tienen ventajas significativas en un mejor aislamiento de una sola unidad que los electrodos individuales16,17,además de la rentabilidad y la rigidez mecánica. También proporcionan mayores rendimientos de las actividades deuna sola unidad cuando se combinan con micromotores 8,18,19,20. Es esencial aumentar el número de neuronas simultáneamente registradas para entender la función de los circuitos neuronales21. Por ejemplo, se necesita un gran número de celdas para investigar pequeñas poblaciones de tipos de células funcionalmente heterogéneos, como22 relacionados con el tiempo o recompensar la codificación23 celdas. Se requieren números de celda mucho más altos para mejorar la calidad de decodificación de las secuencias de picos13,24,25.
Los tetrodes, sin embargo, tienen una desventaja en el registro de células distribuidas espacialmente, como en la corteza o el tálamo. A diferencia de los tetrodes, las sondas de silicio pueden proporcionar distribución espacial e interacción de potenciales de campo locales (LFP) y actividades de espiga dentro de una estructura local14,26. Las sondas de silicio multivástago aumentan aún más el número de sitios de grabación y permiten la grabación en estructuras individuales o vecinas27. Sin embargo, tales matrices son menos flexibles en el posicionamiento de los sitios de electrodos en comparación con los tetrodios. Además, se requieren algoritmos complejos de clasificación de picos en sondas de alta densidad para extraer información sobre los potenciales de acción de los canales vecinos para reflejar los datos adquiridos por los teturos28,29,30. Por lo tanto, el rendimiento general de las unidades individuales es a menudo menor que los tetrodes. Además, las sondas de silicio son desventajosas debido a su fragilidad y alto costo. Por lo tanto, la elección de tetrodes frente a las sondas de silicio depende del objetivo de la grabación, que es una cuestión de si se prioriza la obtención de un alto rendimiento de unidades individuales o perfiles espaciales en los sitios de grabación.
Además de registrar la actividad neuronal, la manipulación optogenética se ha convertido en una de las herramientas más potentes en neurociencia para examinar cómo los tipos y/o vías celulares específicos contribuyen a las funciones del circuito neural13,31, 32,33. Sin embargo, los experimentos optogenéticos requieren una consideración adicional en el diseño de la matriz de micromotores para conectar el conector de fibra a las fuentes de luz de estimulación34,35,36. A menudo, la conexión de fibra óptica requiere una fuerza relativamente grande, lo que puede conducir a un cambio mecánico de la sonda en el cerebro. Por lo tanto, no es una tarea trivial combinar una fibra óptica implantable con matrices de micromotores convencionales.
Por las razones anteriores, los investigadores están obligados a optimizar la selección del tipo de electrodo o a implantar una fibra óptica dependiendo del objetivo de la grabación. Por ejemplo, los tetrodes se utilizan para lograr un mayor rendimiento unitario en el hipocampo1,13, mientras que las sondas de silicio se utilizan para investigar el perfil de profundidad laminar de áreas corticales, como la corteza entorrinal medial (MEC)37. Actualmente, se han notificado micromotores para la implantación simultáneade tetrodes y sondas de silicio para ratas 5,11. Sin embargo, es extremadamente difícil implantar múltiples tetrodios y sondas de silicio en ratones debido al peso de las microunidades, espacio limitado en la cabeza del ratón y requisitos espaciales para diseñar el micromotor para emplear diferentes sondas. Aunque es posible implantar sondas de silicio sin micromotor, este procedimiento no permite el ajuste de la sonda y reduce la tasa de éxito de la recuperación de sondas de silicio12,38. Además, los experimentos optogenéticos requieren consideraciones adicionales en el diseño de matrices de micromotores. Este protocolo demuestra cómo construir e implantar una matriz de micromotores para la grabación crónica en ratones en movimiento libre, lo que permite la implantación de nueve tetrodes ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable. Esta matriz de micromotores también facilita los experimentos optogenéticos y la recuperación de la sonda de silicio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo demuestra cómo construir e implantar una matriz híbrida de micromotores que permite el registro de actividades neuronales desde dos áreas cerebrales utilizando tetrodes ajustables independientes y una sonda de silicio en ratones que se comportan libremente. También demuestra experimentos optogenéticos y la recuperación de la sonda de silicio después de los experimentos. Mientras que la sonda de silicio ajustable33 o la implantación de la sonda de optosilicio3…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la Sociedad Japonesa para la Promoción de las Becas de Investigación en el Extranjero de la Ciencia (HO), el Programa de Académicos Dotados (TK), el Programa de Ciencia de la Frontera Humana (TK), la Fundación para la Investigación Cerebral (TK), la Adquisición de Ciencia sindicación y tecnología y Programa de Retención (TK), Brain & Behavior Research Foundation (TK), y por The Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young Investigator Research Grant (JY). Agradecemos a W. Marks por valiosos comentarios y sugerencias durante la preparación del manuscrito.
Materials
| #00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
| #0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
| #0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
| 22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
| 23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
| 23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
| 26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
| 30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
| 3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
| 3D printer | FormLab | Form2 | |
| 5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
| conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
| customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
| customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
| dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
| dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
| drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
| eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
| fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
| fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
| gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
| ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
| headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
| impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
| mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
| optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
| silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
| silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
| silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
| silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
| skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
| standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
| super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
| surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
| Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
| tetrode wires | Sandvik | PX000004 |
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