Detta protokoll beskriver byggandet av en hybrid Microdrive array som möjliggör implantation av nio oberoende justerbara tetrodes och en justerbar OPTO-kisel sond i två hjärnregioner i fritt rörliga möss. Också visat är en metod för att säkert återhämta sig och återanvända OPTO-kisel sond för flera ändamål.
Multiregionala neurala inspelningar kan ge viktig information för att förstå fina tidsskalan interaktioner mellan flera regioner i hjärnan. Konventionella Microdrive konstruktioner tillåter ofta endast användning av en typ av elektrod för att spela in från en eller flera regioner, vilket begränsar avkastningen av en enhet eller djup profil inspelningar. Det begränsar också ofta förmågan att kombinera elektrod inspelningar med optogenetiska verktyg för att rikta väg och/eller celltyp specifik aktivitet. Presenteras här är en hybrid Microdrive array för fritt rörliga möss för att optimera avkastningen och en beskrivning av dess tillverkning och återanvändning av Microdrive array. Den nuvarande designen sysselsätter nio tetrodes och en opto-kisel sond implanteras i två olika hjärnområden samtidigt i fritt rörliga möss. Den tetrodes och OPTO-Silicon sonden är oberoende justerbar längs dorsoventral axeln i hjärnan för att maximera avkastningen av enhet och oscillerande aktiviteter. Denna Microdrive Array innehåller också en uppsättning för ljus, medla optogenetisk manipulation för att undersöka den regionala-eller celltyp-specifika svar och funktioner av långväga neurala kretsar. Dessutom kan OPTO-silikonsonden säkert återvinnas och återanvändas efter varje experiment. Eftersom Microdrive-matrisen består av 3D-tryckta delar, kan utformningen av mikroenheter enkelt modifieras för att rymma olika inställningar. Först beskrivs är utformningen av Microdrive array och hur man fäster den optiska fiber till en kisel sond för optogenetik experiment, följt av tillverkning av tetrode bunt och implantation av matrisen i en mushjärna. Inspelningen av lokala fält potentialer och enhet tillsatta kombinerat med optogenetisk stimulering visar också genomförbarheten av Microdrive array system i fritt rörliga möss.
Det är viktigt att förstå hur neuronala aktivitet stöder kognitiv process, såsom inlärning och minne, genom att undersöka hur olika hjärnregioner dynamiskt interagerar med varandra. För att belysa dynamiken i neurala aktiviteten underliggande kognitiva uppgifter, storskalig extracellulär elektrofysiologi har utförts i fritt rörliga djur med hjälp av Microdrive arrayer1,2,3, 4. Under de senaste två decennierna, flera typer av Microdrive array har utvecklats för att implantatet elektroder i flera regioner i hjärnan för råttor5,6,7,8 och möss9, 10 , elva , 12. icke desto mindre, nuvarande Microdrive konstruktioner i allmänhet inte tillåter användning av flera sond typer, tvingar forskarna att välja en enda elektrodtyp med specifika fördelar och begränsningar. Till exempel, tetrode matriser fungerar bra för tätbefolkade hjärnregioner såsom dorsala Hippocampus CA11,13, medan kisel sonder ger en bättre geometrisk profil för att studera anatomiska anslutningar14 , 15.
Tetroder och kisel sonder används ofta för in vivo kronisk inspelning, och varje har sina egna fördelar och nackdelar. Tetrodes har visat sig ha betydande fördelar i bättre enhets isolering än enstaka elektroder16,17, förutom kostnadseffektivitet och mekanisk styvhet. De ger också högre avkastning av enstaka enhet verksamhet i kombination med Microdrive-8,18,19,20. Det är viktigt att öka antalet samtidigt inspelade neuroner för att förstå funktionen av neurala kretsar21. Till exempel behövs ett stort antal celler för att undersöka små populationer av funktionellt heterogena celltyper såsom tidsrelaterade22 eller belöning kodning23 celler. Mycket högre cell nummer krävs för att förbättra avkodnings kvaliteten på Spike sekvenser13,24,25.
Tetrodes har dock en nackdel med att spela in rumsligt distribuerade celler, såsom i cortex eller thalamus. I motsats till tetrodes kan silikon sonder ge rumslig distribution och interaktion av lokala fält potentialer (lfps) och tillspikning verksamhet inom en lokal struktur14,26. Flera skaft silikon sonder ytterligare öka antalet inspelningsplatser och tillåta inspelning över enskilda eller angränsande strukturer27. Emellertid, sådana arrayer är mindre flexibla i placeringen av elektrod platser jämfört med tetrodes. Dessutom krävs komplexa Spike sortering algoritmer i hög densitet sonder för att extrahera information om åtgärder potentialer av angränsande kanaler för att spegla de data som förvärvats av tetrodes28,29,30. Därför är den totala avkastningen av enskilda enheter ofta mindre än tetrodes. Dessutom är kisel sonder ofördelaktiga på grund av sin bräcklighet och höga kostnader. Sålunda, valet av tetrodes vs Silicon sonder beror på syftet med inspelningen, vilket är en fråga om huruvida få en hög avkastning på enstaka enheter eller rumslig profilering på inspelningsplatser prioriteras.
Förutom att registrera neurala aktivitet har optogenetisk manipulation blivit en av de mer kraftfulla verktyg i neurovetenskap för att undersöka hur specifika celltyper och/eller vägar bidrar till neurala krets funktioner13,31, 32,33. Emellertid, optogenetiska experiment kräver ytterligare övervägande i Microdrive array design för att fästa fiber kontakten till stimulering ljuskällor34,35,36. Ofta kräver anslutning fiber-optik en relativt stor kraft, vilket kan leda till en mekanisk förskjutning av sonden i hjärnan. Därför är det inte en trivial uppgift att kombinera en implanable optisk fiber till konventionella Microdrive arrayer.
Av ovanstående skäl, forskare är skyldiga att optimera valet av vilken typ av elektrod eller att implantatet en optisk fiber beroende på syftet med inspelningen. Till exempel tetrodes används för att uppnå högre enhet avkastning i hippocampus1,13, medan kisel sonder används för att undersöka laminär djup profil av kortikala områden, såsom mediala entorhinal Cortex (MEC)37. För närvarande, Microdrive-för samtidig implantation av tetrodes och kisel sonder hade rapporterats för råttor5,11. Det är dock oerhört utmanande att implantatet flera tetroder och kisel sonder i möss på grund av vikten av mikroenheter, begränsat utrymme på mus huvudet, och rumsliga krav för utformningen av Microdrive att anställa olika sonder. Även om det är möjligt att implantatet kisel sonder utan en Microdrive, detta förfarande tillåter inte för justering av sonden och sänker framgångs graden av kisel-sond återhämtning12,38. Dessutom kräver optogenetiska experiment ytterligare överväganden i Microdrive array design. Detta protokoll visar hur man konstruerar och implantat en Microdrive array för kronisk inspelning i fritt rörliga möss, vilket möjliggör implantation av nio oberoende justerbara tetrodes och en justerbar OPTO-Silicon sond. Denna Microdrive array underlättar också optogenetiska experiment och återvinning av kisel sonden.
Protokollet visar hur man konstruerar och implantat en hybrid Microdrive array som möjliggör inspelning av neurala aktiviteter från två hjärnområden med hjälp av oberoende justerbara tetrodes och en kisel-sond i fritt beter möss. Det visar också optogenetiska experiment och återvinning av kisel sonden efter experiment. Även justerbar kisel sond33 eller OPTO-kisel sond36 implantation har tidigare visats hos möss, detta protokoll har tydliga fördelar i den samtid…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av Japan Society för främjande av vetenskap utomeuropeiska forskningsstipendier (HO), begåvad Scholar program (TK), Human Frontier Science program (TK), hjärnforskning Foundation (TK), fakultet vetenskap och teknik förvärv och Retention program (TK), hjärnan & beteende Research Foundation (TK), och av Sumitomo Foundation Research Grant (JY), NARSAD Young prövarens Research Grant (JY). Vi tackar W. Marks för värdefulla kommentarer och förslag under utarbetandet av manuskriptet.
#00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
#0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
#0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
3D printer | FormLab | Form2 | |
5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
tetrode wires | Sandvik | PX000004 |