Här presenterar vi ett protokoll för minimalinvasiv kirurgisk lesioning av muskler inneboende till utfodring apparaten av den marina mollusk Aplysia californica att förstå rollerna för dessa muskler under utfodring beteende.
Aplysia californica är ett modellsystem för att studera den neurala kontrollen av inlärning och beteende. Detta djur har en semi-öppna cirkulationssystemet, vilket gör det möjligt att komma åt många av dess interna strukturer utan att orsaka några betydande skador. Många manipulationer kan enkelt utföras både in vivo och in vitro, vilket gör det till en mycket tractable modell för analys av beteende och neurala kretsar. För att bättre förstå funktionerna i musklerna inom utfodring grasper, har vi utvecklat en teknik för att lesioning dem utan att öppna kroppens huvud hålighet av djuret eller skadar de yttre lagren av utfodring organ (dvs, den buckala massan). I denna teknik är grasper delvis everted, vilket ger direkttillgång till muskulaturen. Detta förfarande tillåter djur att återhämta sig snabbt och tillförlitligt. Detta har gjort det möjligt att lesion i7 musklerna och sub-radular fibrer, så att vi kan visa att båda musklerna avsevärt bidra till öppnandet in vivo.
Utfodringssystemet av aplysia californica har en lång historia av användning som modellsystem för att förstå inlärning och minne1, motiverade beteenden2,3, och samspelet mellan beteende, biomekanik och neurala kontroll under utfodring4. Den har mycket tillgängliga neurala kretsar, med ett relativt litet antal stora, identifierbara nervceller. Djuret har ett semi-öppet cirkulationssystem, vilket gör det möjligt att komma åt många av dess interna strukturer utan att orsaka betydande skador. Det är också robust för många manipulationer både in vivo och in vitro, vilket gör det en mycket tractable modell för analys av beteende och neurala kretsar.
För att förstå de neurala mönster som ger upphov till utfodring beteenden, är det viktigt att beskriva den bakomliggande mekaniken i den mjuka strukturen som utgör utfodring orgel, den buckala massan4. Även om det har gjorts arbete för att karakterisera de yttre musklerna som utgör den buckala massan5,6, de inre musklerna i den underliggande strukturen i buckala massan som styr ytan av grasper, den odontophore, har till stor del otillgängliga för in vivo experiment. Även om det har förekommit in vitro-studier på funktionerna hos några av dessa muskler7,8, bristen på direkttillgång till dessa muskler har gjort det svårt att studera deras roll i intakt, beter sig djur.
De flesta tekniker för elektrod implantation eller lesioner i aplysia eller liknande blötdjur arter kräver att kroppen väggen öppnas9,10,11,12. Öppna kroppen väggen orsakar epitelial skada, och snittet måste vara säkert förseglade för att förhindra hemolymfa flykt. Ännu allvarligare svårigheter ställs när man försöker nå de inre musklerna i grasper av Aplysia (muskler som ligger bakom den radulär ytan eller inom odontophore): efter att ha gått igenom de viktigaste kroppens hålighet, måste man sedan gå igenom några del av muskelväggen i buckala massan för att få tillgång till de inre strukturerna (figur 1a). Denna ackumulerade skada och svårighet att få tillgång har gjort tillvägagångssättet genom konventionella medel problematiska eftersom djuren inte återhämta sig väl från dessa operationer (av djur med full eversions, endast 17% återfick någon utfodring förmåga, N = 12. Omkring 85% av icke-everted djur återfick förmågan att föda, N = 84).
I7 muskeln, som har karakteriserats som en radular öppnare8, är djupt inne i odontophore själv, ytterligare komplierar tillgång. Den sträcker sig mellan basen av radularis stjälk (figur 1c) och undersidan av radular ytan, genom en lumen i odontophore (figur 1c). På tre sidor av i7 musklerna är väggar av muskler, och den fjärde väggen består av radular stjälken. Vid tillämpning av en biomekanisk studie skulle en större försämring av någon av dessa strukturer äventyra matnings apparatens normala funktion. Vi utvecklade en ny metod för att arbeta i odontophore ut genom käkarna, och genomföra operationen genom ett snitt till den tunna, brosk radular yta, som gjorde det möjligt att lesion i7 muskeln, liksom nyligen beskrivna fina muskelfibrer som kör precis under radular ytan, som vi kallar sub-radulär fibrer (figur 1c).
Figur 1: anatomisk översikt. A) placeringen av den buckala massan i aplysia. B) odontophores yttre anatomi. Ytan av Radula och radular SAC är gula; muskler som komponerar odontophore visas i rött, baserat på deras faktiska färger. (C) sagittal avsnitt av odontophore, visar placeringen av sub-radular fibrer (böjda rosa linje) och i7 muskel (rak rosa linje). Tvärsnittet av i6 muskeln visas i mörkt rött. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
De mest kritiska stegen i protokollet är behovet av att se till att djuret är helt sövda, och att Eversion av buckala massan är precis tillräckligt för att få tillgång till de underliggande musklerna. Det kan kräva lite övning för att perfekt dessa steg, men när de behärskar, avkastningen från operationer kommer sannolikt att vara större än 85% av alla experiment gjort. Det viktigaste sättet att korrekt ändra och felsöka protokollet är att tillbringa tid att göra dissektioner av buckala massan så att de platser för de inre musklerna är helt klart för prövaren. Eftersom den föreslagna snittet genom radular ytan oundvikligen orsakar vissa skador på den underliggande sub-radulär fibrer, det kan vara lämpligt att ändra den exakta placeringen av snittet för att undvika specifika regioner av dessa fibrer.
En begränsning av den kirurgiska tekniken är att det kan ha icke-specifika effekter på utfodring svar, såsom styrkan av protraction. Ett sätt att övervinna denna begränsning är att få djuren att fungera som egna kontroller. Dessutom är det viktigt att ha en bluff lesion grupp som utsätts för hela kirurgiska protokollet med undantag för avlägsnande av den specifika muskeln (dvs i7 eller SRFs). Genom att följa dessa förslag, en utredare kommer att minska effekterna av variationer mellan djur och har ett inneboende mått på de icke-specifika effekterna av kirurgi.
Tidigare arbete har använt metoder genom kroppen väggen till lesion eller spela in antingen från nerver13,14, eller muskler15,16,17. I vårt laboratorium, vi har anekdotiskt observerade att kroppen vägg snitt är ofta åtföljs av en betydande förlust av hemolymfa och därmed av kroppsvolym. Djur kräver ofta flera dagar att återhämta sig från detta, och om kroppen väggen lesion inte är noggrant sutured, djur får inte återhämta. Dessutom, post-mortem undersökning av djuren avslöjar betydande ärrbildning runt snittet och ett starkt immunsvar (anekdotiska observationer). Däremot, djur visar ingen förlust av hemolymfa eller förändring i kroppsvolym efter återhämtning från det protokoll som beskrivs här (baserat på observationer i 96 djur).
Framtida tillämpningar av tekniken kan förlänga den till andra muskler inom utfodringsapparaten av Aplysia, och till andra djur. Vi har fokuserat på avlägsnande av i7 muskeln och sub-radular fibrer. Dessa samma allmänna kirurgiska tekniker ger också tillgång till de flesta av de andra musklerna i odontophore. Några av dessa, såsom den inre delen av i5 muskeln, är bäst nås genom radular ytan. Andra, liksom de inre broschyrer av I4, kan bättre nås genom utsidan epitel av odontophore. Vi har gjort preliminära prövningar där ett snitt under radular kluven av den delvis vrängs odontophore får tillgång till en vass krok som skall införas som sedan kan användas för att lesion en annan muskel inom odontophore, muskel i88. Eftersom det kirurgiska protokollet som beskrivs här inte öppnar huvud kroppens hålighet, ingen suturering krävs.
Det protokoll som vi har beskrivit kan vara av allmänt intresse för andra utredare som arbetar med mjukvävnads strukturer som annars skulle vara svåra att manipulera, t. ex. Mer allmänt, detta protokoll kan föreslå andra nya kirurgiska metoder för analys av mjuka strukturer såsom tungor, stammar eller tentakler18.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja erkänna det hårda arbete som Sherry Niggel, Sisi Lu, och Joey Wu sätta på att förbättra och validera dessa protokoll. Detta arbete stöddes av NSF Grant IOS 1754869.
Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
Webcam | Logitech | c920 | for recording data |