En forbedret Green fluorescens protein-basert analyse for å studere Neurite utvekst i primær neurons

Summary

I denne rapporten beskriver vi en enkel protokoll for å studere neurite utvekst i embryonale rotte kortikale neurons av co-transfecting med EGFP og protein av interesse.

Abstract

Neurite utvekst er en fundamental hendelse i dannelsen av nevrale kretser under nervesystemet utvikling. Alvorlig neurite Kader og Synaptic dysfunksjon forekommer i ulike nevrodegenerative sykdommer og alder-relaterte degenerasjon. Gransking av mekanismene som regulerer neurite utvekst ville ikke bare kaste verdifullt lys på hjernens utviklingsmessige prosesser, men også på slike nevrologiske lidelser. På grunn av den lave transfeksjoner effektivitet, er det for tiden utfordrende å studere effekten av et bestemt protein på neurite utvekst i primære pattedyr neurons. Her beskriver vi en enkel metode for undersøkelse av neurite utvekst av transfeksjoner av primære rotte kortikale neurons med EGFP og et protein av interesse (POI). Denne metoden tillater identifisering av POI transfekterte neurons gjennom EGFP signalet, og dermed effekten av POI på neurite utvekst kan bestemmes presist. Dette EGFP-baserte analysen gir en praktisk tilnærming for etterforskning av trasé regulere neurite utvekst.

Introduction

Neurites, inkludert både axons og dendrites, er anslagene fra neurons involvert i etableringen av nevrale nettverk. Den dynamiske utvekst av neurites er avgjørende for neurodevelopment. Imidlertid er de underliggende regulatoriske mekanismene under fortsatt uklare. Spesielt neurite Kader er ofte observert i ulike nevrodegenerative sykdommer og etter hjerne skader¹. Derfor vil gransking av rollene til antatte molekyler i ulike neurite utvekst regulatoriske trasé forbedre vår forståelse av prosessen. Videre kan det avsløre romanen terapeutiske mål for ulike nevrologiske lidelser. Neuronal cellelinjer er verdifulle modeller for å studere neuronal prosesser inkludert neurite utvekst som de er enkle å manipulere og transfect^2,3. Imidlertid har genetisk drift blitt rapportert å forekomme i noen brukte cellelinjer, noe som kan føre til variasjoner i deres fysiologiske svar⁴. Videre har differensial protein uttrykk blitt vist mellom neuronal cellelinjer og primære neurons. For eksempel, PC12, en neuronal cellelinje avledet fra rotte binyrene som er mye brukt for å studere neurite utvekst^2,3, ikke uttrykke NMDA reseptorer⁵. Videre har det vært foreslått at den reduserte responsen på musen neuroblastom linje Nevro-2a til nervegifter i forhold til primære neurons skyldes mangel på uttrykk for visse membran reseptorer og Ion-kanaler⁶. Derfor primære neurons er en mer ønskelig og representativ modell for etterforskningen av neurite utvekst. Imidlertid er bruken av primære neurons hindret av deres lave transfeksjoner effektivitet⁷.

Her beskriver vi en metode som involverer co-transfeksjoner av protein av interesse (POI) og EGFP til primære rotte kortikale neurons. Den EGFP fungerer som en morfologiske markør for identifisering av vellykket transfekterte neurons og tillater måling av neurites. Vi validerte denne metoden ved hjelp av forbindelser/molekyler som er rapportert til modulere neurite utvekst. Dess, FE65, en neuronal adapter protein som har vist seg å stimulere neurite utvekst, ble brukt for å illustrere denne tilnærmingen^8,9. Denne protokollen innebærer (1) isolering av primære kortikale neurons fra embryonale dag 18 (E18) rotte embryo, (2) transfeksjoner av neurons med EGFP og POI (FE65 i denne studien) og (3) Imaging og analyse av neurons ved hjelp av bildebehandling programvare ImageJ med NeuronJ plugin^10,11.

Protocol

Alle prosedyrer fulgte var i samsvar med etiske standarder for dyret eksperimentering etikk komiteen av det kinesiske Universitetet i Hong Kong. 1. utarbeidelse av Coverslips Plasser en steril 18 mm sirkulær dekkglass i hver brønn på en 12-brønn vev kultur plate. Coat dekkglass med 5 μg/mL Poly-D-lysin løsning i en fuktet 37 ° c inkubator i minst 1 time. Aspirer den Poly-D-lysin løsning fra vevet kulturen plate og skyll belagt coverslips gang med sterilt v…

Representative Results

For å teste denne metodikken, brukte vi cyto D og nerve vekstfaktor NGF, som har vist å hemme og stimulere neurite utvekst henholdsvis14,15,16. Den neurite lengden av neurons transfekterte med EGFP ble målt etter behandling med cyto D eller NGF. Den transfeksjoner effektiviteten av EGFP til neurons var 2,7% (1 068 neurons telles). Som vist i figur 1A</stro…

Discussion

Som nevnt tidligere, PC12 og dens subclones er mye brukt for å studere neurite forlengelse fordi de har utmerket transfeksjoner effektivitet^2,3. I kontrast primære neurons har en lav transfeksjoner rate, som er et stort hinder for å studere neurite utvekst regulatorer ved transfeksjoner⁷. Her beskriver vi en praktisk protokoll for kvantifisere neurite utvekst i primære neurons. Til tross for den lave generelle transfeksjoner effektivit…

Materials

#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use.
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO.
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061