Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Summary

Este protocolo usa peptídeos mistos G6PI para construir modelos de artrite reumatoide que estão mais próximos do da artrite reumatoide humana em células CD4⁺ T e citocinas. Células T assassinas naturais invariantes de alta pureza (principalmente iNKT2) com fenótipos e funções específicas foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro para imunoterapia adotiva.

Abstract

Artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória crônica autoimune complexa. A patogênese da doença está relacionada com células invariantes assassinas naturais T (iNKT). Pacientes com RA ativa apresentam menos células iNKT, função celular defeituosa e polarização excessiva de Th1. Neste estudo, foi estabelecido um modelo animal RA utilizando uma mistura de hGPI325-339 e hGPI469-483 peptídeos. As células iNKT foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro, seguidas de infusão em camundongos RA para imunoterapia adotiva. O rastreamento do sistema de imagem in vivo (IVIS) revelou que as células iNKT foram distribuídas principalmente no baço e fígado. No dia 12 após a terapia celular, a progressão da doença desacelerou significativamente, os sintomas clínicos foram aliviados, a abundância de células iNKT no timo aumentou, a proporção de iNKT1 no timo diminuiu, e os níveis de TNF-α, IFN-γ, e IL-6 em o soro diminuiu. A imunoterapia adotiva das células iNKT restaurou o equilíbrio das células imunes e corrigiu a inflamação excessiva do corpo.

Introduction

A artrite reumatoide (RA) é uma doença autoimune caracterizada por incomodade crônica e progressiva com incidência de 0,5 a 1%^1,2. A patogênese subjacente é atribuída à proliferação anormal das células CD4⁺ e CD8⁺ T, manifestadas por um aumento na proporção de células CD4⁺IFN-γ⁺ e CD4⁺IL-17A⁺ T, e o número reduzido de células CD4⁺IL-4⁺ e CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ T. Portanto, a secreção de citocinas inflamatórias é aumentada, e uma reação inflamatória excessiva destrói o equilíbrio nativo e a função de tolerância do sistema imunológico do corpo. Além disso, o ajudante T linfócito (Th) 1 células que penetram na articulação agravam a resposta inflamatória e danos articulares. Portanto, a inibição da resposta inflamatória excessiva e da restauração da tolerância imunológica e do equilíbrio imunológico são fundamentais para o tratamento de RA^3,4.

As células iNKT têm funções e características das células NK e t. As células iNKT abrigam uma cadeia de células T distintae e invariante (TCR) com repertórios limitados de β-cadeia TCR⁵ e reconhecem o antígeno glicolipídico apresentado pelo maior complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I CD1d na superfície das células presentes em antígenos. Mitsuo et al.⁶ detectaram um grande número de células iNKT e defeitos funcionais em muitas doenças autoimunes, incluindo ra. Aurore et al.⁷ demonstraram que as células iNKT têm um efeito positivo na manutenção da tolerância autoimune e que quando o número e a função das células iNKT são restaurados, a doença é aliviada. Além disso, Miellot-Gafsou et al.⁸ descobriram que as células iNKT não só revogaram a doença, mas também aumentaram a progressão da doença. Esses resultados contraditórios sugerem que as células iNKT são células T heterogêneas, e a função de diferentes subconjuntos pode ser revertida. Em um estudo clínico de RA, a frequência de células iNKT correlacionada com o escore da atividade da doença⁹. Os resultados também confirmaram que a frequência do iNKT foi reduzida em pacientes com RA, o número de subconjuntos de células CD4⁺IFN-γ⁺ T aumentou, e os níveis secretos de citocinas inflamatórias IFN-γ e TNF-α aumentaram^10,11. Além disso, Sharif et al.¹² investigados diabetes tipo 1 (T1D) e descobriram que a infusão seletiva de células iNKT upregulamentou a expressão da citocina inflamatória IL-4, manteve a tolerância imune e impediu o desenvolvimento do diabetes tipo 1. Portanto, a infusão adotiva de células iNKT específicas ou ativação direcionada de células iNKT aumenta o nível de células iNKT em pacientes com RA, o que pode ser um avanço no tratamento de RA.

A imunoterapia celular é atualmente de grande interesse e tem sido amplamente utilizada na terapia contra o câncer. No entanto, as células iNKT são células imunoreguladoras raras e heterogêneas (apenas 0,3% do número total de PBMCs)¹³, o que limita potenciais aplicações clínicas. Essas células são divididas principalmente em três subpopulações: 1) células iNKT1, que têm uma alta expressão de proteína promielocítica de zinco -finger protein (PLZF) e fator de transcrição t-box (T-bet); 2) células iNKT2 com expressão intermediária de PLZF e proteína de ligação GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 com baixa expressão de PLZF e receptor nuclear órfão relacionado a retinóides (ROR)-γt que secretam IFN-γ, IL-4 e IL-17¹⁴. Células iNKT ativadas secretam citocinas semelhantes a Th1, Th2 e Th17, que determinam os diferentes efeitos imunomodulatórios das células iNKT¹⁵. Os efeitos imunomodulatórios e imunoterapêuticos da ativação específica de várias subpopulações de células iNKT são diferentes. Portanto, a seleção de fenótipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) com funções anti-inflamatórias para regular a resposta imune do corpo pode corrigir o desequilíbrio imunológico e as doenças imunológicas em RA.

O estabelecimento de um modelo animal ideal é de grande importância para o tratamento e estudo da patogênese ra. Atualmente, os modelos animais mais usados e maduros incluem artrite induzida por colágeno, artrite adjuvante, artrite induzida por zimosan e artrite induzida por polissacarídeo^16–17. No entanto, não há um modelo que possa simular totalmente todas as características do RA humano. Artrite induzida por colágeno tipo II (CIA) é um modelo clássico de artrite. A CIA é induzida pela imunização de camundongos com anticorpos monoclonais específicos de colágeno tipo II, refletindo a dependência de anticorpos desse modelo da doença. Benurs et al. descreveram um modelo com uma resposta imune sistêmica à isomerase glicose-6-fosfato (G6PI), que induz poliartrite simétrica periférica em cepas de camundongos suscetíveis^18,19. Nesse modelo, o desenvolvimento da artrite depende de células T, células B e imunidade inata^18,19,20. Horikoshi²¹ descobriu que os modelos RA resultantes da imunização de camundongos DBA/1 com fragmentos de polipeptídeo G6PI são mais semelhantes ao RA humano em termos de células CD4⁺ T e citocinas (ou seja, IL-6 e TNF-α) do que os modelos da CIA. Para aumentar o efeito estimulante no local de reconhecimento do TCR, os fragmentos de polipeptídeo misto do G6PI (hGPI325-339 e hGPI469-483) foram usados para imunizar camundongos DBA/1 para construir o modelo de camundongora RA. A taxa de sucesso dessa abordagem pode ser alta porque hGPI325-339 e hGPI469-483 são imunodominantes para respostas de células T restritas a Q I-A. Portanto, este modelo pode simular a superproliferação de células CD4⁺ T e defeitos celulares iNKT em pacientes^{RA 22}. A pesquisa básica da imunopatologia ra estabeleceu as bases para nossa investigação mais aprofundada.

Protocol

Todos os camundongos experimentais (150 no total) eram camundongos saudáveis de DBA/1 masculino, 6-8 semanas de idade (20,0 ± 1,5 g), criados em um ambiente específico sem patógenos (FPS). Não há tratamento especial antes de ser modelo. O experimento foi dividido em um grupo de controle saudável (15 camundongos), um grupo de controle de modelos (15 camundongos) e um grupo de terapia celular (55 camundongos). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética da Universidade hebei. <p class="jov…

Representative Results

A pontuação do índice de artrite e a espessura da pata aumentaram após a modelagem. Em comparação com o grupo controle, os dedos do grupo modelo RA começaram a mostrar inchaço vermelho em 6 dias após a modelagem, com agravamento gradual. Aos 14 dias, o inchaço vermelho na articulação do tornozelo atingiu o pico, seguido de alívio gradual. A espessura da pata mudou de forma semelhante (P < 0,05) (Figura 1). A infiltração celular inflamatóri…

Discussion

As células iNKT são células T especiais que fazem a ponte imunidade inata e adaptativa e são desenvolvidas principalmente a partir de CD4⁺⁺/CD8⁺ thymocytes. As células iNKT têm funções imunoregulatórias diversas e interagem com outras células imunes por contato direto e secreção de diferentes citocinas²³, afetando células dendríticas (DCs), macrófagos, nêutrons, células B, células T e diferenciação e desenvolvimento celular NK<sup c…

Materials

Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF	BD	563490	America
Anti-PE MicroBeads	Miltenyi	130-048-801	Germany
Columns	Miltenyi	MS	Germany
Cryogenic Centrifuge	Beckman	Allegra® X-15R	America
DiR	Thermo Fisher Scientific	D12731	America
Embedding Center	Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.	BMJ-1	China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain	BD	553170	America
Flow cytometer	BD	Accuri C6	America
Freund's complete adjuvant	Sigma	F5881	America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)	Karebay Biochem	18062202	China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)	Karebay Biochem	18062203	China
In Vivo Imaging System	PerkinElmer	caliper IVIS lumina II	America
Ionomycin Calcium	Cayman	10004974	America
KRN7000	AdipoGen	AG-CN2-0013	America
Mouse CD1d Tetramer-PE	MBL	TS-MCD-1	Japan
Mouse percoll	Solarbio	P8620	China
Optical Microscope	Olympus	Olympus-II	Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt	BD	562683	America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet	BD	561316	America
Pertussis toxin	Sigma	P7208	America
phorbol esters	Cayman	10008014	America
Red Blood Cell Lysis Buffer	BD	555899	America
RPMI-1640	Biological Industries	01-100-1ACS	Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit	BD	560485	America
Ultramicrotome	Leica	Leica EM UC6	Germany