포도당-6-인산염 이사머라제(G6PI)-유도 RA 마우스에서 iNKT 세포의 입양 면역 요법
Summary
이 프로토콜은 G6PI 혼합 펩티드를 사용하여 CD4+ T 세포 및 사이토카인에서 인간 류마티스 관절염에 가까운 류마티스 관절염 모델을 구성합니다. 고순도 불변 성 천연 킬러 T 세포 (주로 iNKT2) 특정 표현형 및 기능을 가진 채택 면역 요법에 대한 생체 내 유도 및 체외 정제에 의해 수득되었다.
Abstract
류마치스성 관절염 (RA)는 복잡한 만성 선동적인 자기 면역 질병입니다. 질병의 병인은 불변 자연 살인자 T (iNKT) 세포와 관련이 있습니다. 활성 RA를 가진 환자는 Th1의 더 적은 iNKT 세포, 불완전한 세포 기능 및 과도한 편광을 제시합니다. 본 연구에서, RA 동물 모델은 hGPI325-339 및 hGPI469-483 펩티드의 혼합물을 사용하여 확립되었다. iNKT 세포는 생체 내 유도 및 체외 정제에 의해 수득되었고, 이어서 입양 면역 요법을 위해 RA 마우스내로 주입하였다. 생체 내 이미징 시스템(IVIS) 추적은 iNKT 세포가 주로 비장과 간에서 분포되었다는 것을 밝혔다. 세포 치료 후 12일째에, 질병 진행이 현저히 둔화되고, 임상 증상이 완화되었고, 흉선내 iNKT1 세포의 풍부도가 증가하고, 흉선에서 iNKT1의 비율이 감소하고, TNF-α, IFN-γ 및 IL-6의 수준이 감소하였다. 혈청이 감소했습니다. iNKT 세포의 입양 면역 요법은 면역 세포의 균형을 회복시키고 신체의 과도한 염증을 교정했습니다.
Introduction
류마치스성 관절염 (RA)는 0.5-1% 부각1,2를가진 만성, 진보적인 침략을 특징으로 하는 자기 면역 질병입니다. 기본 병인은 자가 반응성 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비정상적인 증식에 기인하며, CD4+IFN-γ+ 및 CD4+IL-17A+ T 세포의 비율의 증가에 의해 나타나며, CD4+IL-4+ 및 CD4 + CD25+FoxP3+T 세포의 감소 된 수에 기인한다. 따라서 염증성 사이토카인의 분비가 증가하고 과도한 염증 반응이 신체의 면역 계통의 기본 균형과 내성 기능을 파괴합니다. 더욱이, 조인을 관통하는 도우미 T 림프구(Th) 1 세포는 염증 반응 및 관절 손상을 악화시다. 따라서 과도한 염증 반응의 억제와 면역 내성 및 면역 균형의 회복은 RA3,4의치료에 핵심이다.
iNKT 세포는 NK 세포 및 T 세포 기능 및 특성을 모두 갖는다. iNKT 세포는 제한된 TCR β 사슬 레퍼토리5를 가진 뚜렷한 불변 T 세포 수용체(TCR) α 사슬을 항원 제시 세포의 표면에 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자 CD1에 의해 제시된 글리콜리파이드 항원을 인식한다. 미츠오 외6은 RA를 포함한 많은 자가면역 질환에서 다수의 iNKT 세포 및 기능적 결함을 검출하였다. Aurore등. 7은 iNKT 세포가 자가면역 내성을 유지하는 데 긍정적인 영향을 미치고 iNKT 세포의 수와 기능이 회복되면 질병이 완화된다는 것을 입증했다. 또한, Miellot-Gafsou 외8 iNKT 세포는 질병을 폐지할 뿐만 아니라 질병의 진행을 증가시키는 것을 발견하였다. 이러한 모순된 결과는 iNKT 세포가 이기종 T 세포이며, 상이한 서브세트의 기능이 역전될 수 있음을 시사한다. RA의 임상 연구에서, iNKT 세포의 빈도는 질병 활성의 점수와 상관관계가있다 9. 결과는 또한 RA 환자에서 iNKT의 빈도가 감소하였고, CD4+IFN-γ+ T 세포 서브세트의 수가 증가하고, 염증성 사이토카인 IFN-γ 및 TNF-α의 분비 수준이 10,11증가함을 확인하였다. 또한, 샤리프 외12형 당뇨병(T1D)을 조사하고 iNKT 세포의 선택적 주입이 염증성 사이토카인 IL-4의 발현을 업테비제, 면역 내성을 유지하고, 제1형 당뇨병의 발병을 방지한 것으로 나타났다. 따라서, 특정 iNKT 세포의 채택 주입 또는 iNKT 세포의 표적화 활성화는 RA 환자에서 iNKT 세포의 수준을 증가시켜, 이는 RA 치료에서 돌파구가 될 수 있다.
세포 면역 요법은 현재 큰 관심사이며 암 치료에 널리 사용되어 왔습니다. 그러나, iNKT 세포는 희소하고 이기종 면역 조절 세포(총 PBMC 수의 0.3%에불과)(13)로잠재적임상 적용을 제한한다. 이들 세포는 주로 3개의 소집단으로 나뉜다: 1) iNKT1 세포, 이는 골수성 백혈병 아연 핑거 단백질(PLZF) 및 T-박스 전사 인자(T-bet)의 높은 발현을 갖는다; 2) PLZF 및 GATA 결합 단백질 3(GATA3)의 중간 발현을 가진 iNKT2 세포; 3) PLZF 및 레티노이드 관련 고아 핵 수용체(ROR)-γt의 발현이 낮은 iNKT17 세포는 IFN-γ, IL-4 및 IL-1714를분비한다. 활성화된 iNKT 세포는 iNKT세포(15)의상이한 면역조절 효과를 결정하는 Th1, Th2 및 Th17 유사 사이토카인을 분비한다. iNKT 세포의 다양한 하위 집단의 특정 활성화의 면역 조절 및 면역 치료 효과는 상이하다. 따라서, 신체의 면역 반응을 조절하는 항염증 기능을 가진 iNKT 세포(주로 iNKT2)의 특정 표현형의 선택은 RA에서의 면역 불균형 및 면역 장애를 교정할 수 있다.
이상적인 동물 모델의 확립은 RA 병인의 치료 및 연구에 큰 의미가 있다. 현재, 가장 일반적으로 사용되고 성숙한 동물 모델은 콜라겐 유도 관절염, 보조 관절염, 자이모산 유도 관절염, 및 다당류 유도 관절염 을 포함한다16–17. 그러나 인간 RA의 모든 기능을 완전히 시뮬레이션할 수 있는 모델은 없습니다. 타입 II 콜라겐 유도 관절염 (CIA)는 고전적인 관절염 모델입니다. CIA는 이 질병 모델의 항체 의존성을 반영하는 타입 II 콜라겐 특이적 단일클론 항체를 가진 마우스의 면역화에 의해 유도된다. Benurs 등은 글루코스-6-인산염 이소머라아제(G6PI)에 대한 전신 면역 반응을 가진 모델을 기술하였는데, 이는 영향을 받기 쉬운 마우스 균주18,19에서말초 대칭 다발성 관절염을 유도한다. 이 모델에서 관절염의 발달은 T 세포, B 세포 및 선천성 면역18,19,20에달려 있습니다. 호리코시21은 G6PI 폴리펩티드 단편을 가진 DBA/1 마우스의 면역화로 인한 RA 모델이 CIA 모델보다CD4+ T 세포 및 사이토카인(즉, IL-6 및 TNF-α)의 관점에서 인간 RA와 더 유사하다는 것을 발견하였다. TCR 인식 부위에 대한 자극 효과를 높이기 위해, G6PI(hGPI325-339 및 hGPI469-483)의 혼합 폴리펩티드 단편을 사용하여 RA 마우스 모델을 구성하기 위해 DBA/1 마우스를 면역화하였다. hGPI325-339 및 hGPI469-483이 I-A q 제한 T 세포 반응에 대한 면역 지배적이기 때문에 이러한 접근법의 성공률은 높을 수 있다. 따라서, 이 모델은 RA 환자22에서CD4+ T 세포 및 iNKT 세포 결함의 과확산을 시뮬레이션할 수 있다. RA 면역 병리학의 기초 연구는 우리의 추가 심층적인 조사를 위한 기초를 놓았습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
iNKT 세포는 선천적이고 적응성 면역을 연결하는 특별한 T 세포이며 주로 CD4++/ CD8+ 흉선 세포에서 개발됩니다. iNKT 세포는 다양한 면역 조절 기능을 가지며 상이한 사이토카인2 3의직접 접촉 및 분비에 의해 다른 면역 세포와 상호작용하며, 수지상세포(DC), 대식세포, 호중구, B세포, T세포 및 NK세포 분화 및개발24에</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리의 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC) (81771755), 허베이성의 대학 및 대학의 과학 기술 핵심 연구 프로젝트 (ZD2017009) 및 허베이 대학의 의학 실험 센터의 동물 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
| Columns | Miltenyi | MS | Germany |
| Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
| DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
| Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
| FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
| Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
| Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
| hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
| hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
| In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
| Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
| KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
| Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
| Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
| Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
| PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
| Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
| phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
| Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
| Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |
Referências
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