작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출
Summary
우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2′-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.
Abstract
차세대 염기서열 분석(NGS)에 의한 소형 RNA(sRNA)에 대한 연구는 도서관 준비 중 편향문제에 의해 도전받고 있습니다. 식물 microRNAs (miRNAs)와 같은 sRNA의 몇몇 모형은 그들의 3′ 말단 뉴클레오티드에서 2′-O-메틸 (2′-OMe) 수정을 전송합니다. 이 수정은 3’어댑터 결찰을 억제하기 때문에 또 다른 어려움을 추가합니다. 이전에는 ‘TruSeq(TS)’ 프로토콜의 수정된 버전이 편향이 적고 2′-OMe RNA의 검출이 개선되었다는 것을 입증했습니다. 여기서는 전체적인 성능을 가장 잘 보여준 프로토콜 ‘TS5’를 자세히 설명합니다. TS5는 TS 키트의 홈메이드 시약 또는 시약을 사용하여 동일한 성능으로 따를 수 있습니다.
Introduction
작은 RNA (sRNA)는 생물 학적 과정의 다양성의 제어에 관여1. 진핵 조절 sRNA는 전형적으로 20 와 30 nt 크기 사이; 3개의 중요한 모형은 microRNAs (miRNA), piwi 상호 작용하는 RNA (piRNA) 및 작은 간섭 RNA (siRNA)입니다. 비정상적인 miRNA 발현 수준은 다양한 질병2에서연루되어 왔다. 이것은 건강과 질병에 있는 miRNAs의 중요성 및 일반적으로 sRNAs를 검출하기 위하여 정확하고 정량적인 연구 공구를 위한 필요함을 강조합니다.
차세대 염기서열 분석(NGS)은 sRNA를 연구하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 정량적 PCR 또는 마이크로어레이 기술(qPCR)과 같은 다른 접근법과 비교하여 NGS의 주요 장점은 sRNA 서열에 대한 사전 지식이 필요하지 않으며 따라서 새로운 RNA를 발견하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 배경 신호 및 채도 효과. 또한, 단일 뉴클레오티드 차이를 검출할 수 있으며 마이크로어레이보다 처리량이 더 높습니다. 그러나 NGS에는 몇 가지 단점이 있습니다. 시퀀싱 실행 비용은 상대적으로 높게 유지되며 시퀀싱을 위해 샘플을 라이브러리로 변환하는 데 필요한 다단계 프로세스가 편향을 유발할 수 있습니다. 전형적인 sRNA 라이브러리 제제 공정에서, 3′ 어댑터는 ATP가 없는 경우 RNA 리가제 2(RNL2) 및 프리아베닐화된 3′ 어댑터의 잘린 버전을 사용하여sRNA(종종 총 RNA로부터 겔 정제)로 먼저 결찰된다. 이는 sRNA 어댑터 결찰의 효율을 증가시키고 sRNA 순환화 또는 연결화와 같은 측 반응의 형성을 감소시킨다. 이어서, 5′ 어댑터는 RNA 리가제 1(RNL1)에 의해 결찰되고, 이어서 역전사(RT) 및 PCR 증폭이 뒤따른다. 이러한 모든 단계는 바이어스3,4를도입 할 수 있습니다 . 따라서 판독값은 인공적인 방법 종속 발현 패턴으로 이어지는 실제 sRNA 발현 수준을 반영하지 않을 수 있습니다. 특정 sRNA는 라이브러리에서 과대 또는 과소 표현될 수 있으며, 강하게 과소 대표되는 sRNA는 탐지를 벗어날 수 있습니다. 상황은 특히 식물 miRNAs, 곤충 및 식물의 siRNAs, 곤충, 선충 및 포유동물의 piRNAs, 있는 3′ 말단 뉴클레오티드가 2′-O-Methyl(2′-OMe) 변형1을갖는다. 이 수정은 3′ 어댑터 결찰5를강력하게 억제하여 이러한 유형의 RNA에 대한 라이브러리 준비를 어려운 작업으로 만듭니다.
이전 작업은 어댑터 결찰이 RNA 서열 /구조 효과6,7,8,9,10,11로인해 심각한 편향을 도입한다는 것을 입증했다. 역전사 및 PCR과 같은 어댑터 결찰의 하류 단계는 바이어스6,11,12에크게 기여하지 않는다. 결찰 편향은 주어진 서열을 가진 어댑터 분자가 반응 혼합물에서 sRNA 분자와 상호 작용하여 공동 접기를 형성할 것이고, 이는 결찰에 대해 유리하거나 불리한 구성으로 이어질 수 있다는사실(도 2)에기인한다. Sorefan 등의 데이터는 RNL1이 단일 가닥 컨텍스트를 선호하는 반면 RNL2는 결찰을 위한 이중 가닥을 선호한다는 것을 시사합니다. 어댑터/sRNA 코폴드 구조가 특정 어댑터 및 sRNA 서열에 의해 결정된다는 사실은 특정 sRNA가 지정된 어댑터 세트와 과대 또는 과소 대표되는 이유를 설명합니다. 또한 일련의 sRNA 라이브러리를 비교할 때 동일한 어댑터 서열을 사용해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 실제로, 상이한 바코드 서열의 도입에 의해 어댑터를 변경하면 시퀀싱 라이브러리9,13에서miRNA 프로파일이 변경되는 것이 관찰되었다.
결찰 접합 부근의 어댑터 서열의 무작위화는 이러한 바이어스를 감소시킬 가능성이 높습니다. Sorefan 및 동료7그들의 사지에 4 개의 무작위 뉴클레오티드를 가진 어댑터를 사용, 지정된 “고화질” (HD) 어댑터, 이러한 어댑터의 사용은 더 나은 진정한 sRNA 발현 수준을 반영하는 라이브러리로 이어질 것으로 나타났다. 보다 최근의 작업은 이러한 관찰을 확인하고 무작위 영역이 결찰접합부(11)에인접할 필요가 없다는 것을 밝혔다. 이 새로운 유형의 어댑터는 “MidRand” 어댑터로 명명되었습니다. 이러한 결과는 향상된 어댑터 설계가 바이어스를 줄일 수 있음을 보여줍니다.
어댑터를 수정하는 대신 반응 조건의 최적화를 통해 바이어스를 억제할 수 있습니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 결찰효율(14)을증가시키는 것으로 알려진 거대 분자 우향제로서, 바이어스15,16을현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 여러 가지 “낮은 바이어스” 키트가 시장에 나타났습니다. 여기에는 고전적인 어댑터 또는 HD 어댑터와 함께 결찰 반응에서 PEG를 사용하는 키트가 포함됩니다. 다른 키트는 결찰을 완전히 피하고 3′ 폴리아데닐레이션 및 템플릿 스위칭을 3′ 및 5′ 어댑터 추가용으로 각각12개사용합니다. 또 다른 전략에서, 3′ 어댑터 결찰은 순환 화 단계 뒤에, 따라서 5′ 어댑터결찰(17)을생략한다.
이전 연구에서는 가능한 가장 낮은 수준의 바이어스와 2′-OMe RNA12의최상의 검출을 갖춘 sRNA 라이브러리 준비 프로토콜을 검색했습니다. 우리는 표준 프로토콜 (TS)보다 2′-OMe RNA의 더 나은 검출을 했다 위에서 언급 한 ‘낮은 바이어스’ 키트의 일부를 테스트. 그러나 놀랍게도, 수정시 (무작위 어댑터의 사용, 결찰 반응에서 PEG 및 정제에 의한 초과 3′ 어댑터의 제거) 후자는 2′-OMe RNA의 검출을 위한 다른 프로토콜을 능가하였다. 여기서는 2′-OMe RNA의 전체 검출이 가장 좋은 TS 프로토콜인 ‘TS5’를 기반으로 하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 TS 키트의 시약과 ‘Nf’ 키트의 시약을 사용하거나, 동일한 성능으로 집에서 만든 시약을 사용하여 비용을 절감할 수 있습니다. 우리는 또한 총 RNA에서 sRNA의 정제 및 preadenylated 3′ 어댑터의 제조를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
작은 RNA 라이브러리 제제는 주로 어댑터 결찰 단계 동안 도입된 바이어스로 인해 여전히 도전적이다. 식물 miRNAs, 곤충의 piRNA, 선충 및 포유동물의 piRNA, 곤충 및 식물의 작은 간섭 RNA(siRNA)와 같은 3′ 말단에서 2′-OMe 변형을 가진 RNA는 2′-OMe 변형이 3′ 적응기 결찰을 억제하기 때문에 연구하기가 특히 어렵습니다. sRNA 라이브러리 준비 프로토콜을 개선하기 위해 문헌에서 다수의 솔루션이 제안되었지만,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 과학 연구를위한 국립 센터에 의해 지원되었다 (CNRS), 프랑스 대안 에너지 및 원자력 위원회 (CEA) 파리 수드 대학. 이 연구를 위한 모든 라이브러리 준비, 일루미나 시퀀싱 및 생물 정보학 분석은 I2BC 차세대 염기서열 분석(NGS) 시설에서 수행되었습니다. I2BC NGS 시설의 구성원은 원고와 유용한 제안의 비판적 독서에 대한 인정된다.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
Referências
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