Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

Claudia Morganti; Massimo Bonora; Keisuke Ito

doi:10.3791/60057

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Artigo de método

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

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DOI:

10.3791/60057

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30 de julho de 2019

Claudia Morganti¹^,²^,³ , Massimo Bonora¹^,²^,³ , Keisuke Ito¹^,²^,³^,⁴

¹Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Research, Albert Einstein College of Medicine, ²Departments of Cell Biology and Stem Cell Institute, Albert Einstein College of Medicine, ³Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, ⁴Albert Einstein Cancer Center and Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Resumo

Como o metabolismo celular é um regulador chave da autorenovação de células-tronco hematopoiéticas (HSC), os vários papéis desempenharam as mitocôndria na homeostase hematopoiética têm sido extensivamente estudados por pesquisadores do HSC. Os níveis de atividade mitocondrial são refletidos em seus potenciais de membrana (Δm), que podem ser medidos por corantes catiônicos celulares, como TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). A capacidade de bombas de efluxo para expulsar esses corantes de células pode limitar a sua utilidade, no entanto. O viés de mensuração resultante é particularmente crítico na avaliação de HSCs, uma vez que os transportadores xenobióticos exibem níveis mais elevados de expressão e atividade em HSCs do que em células diferenciadas. Aqui, nós descrevemos um protocolo que utiliza o verapamil, um inibidor da bomba de efluxo, para medir exatamente o Δ, em várias populações de medula óssea. A inibição resultante da atividade da bomba é mostrada para aumentar a intensidade de TMRM em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs), ao deixá-la relativamente inalterada em frações maduras. Isto destaca a atenção estreita à atividade do tingimento-efflux que é exigida quando os corantes Δm-dependentes são usados, e como escrito e visualizado, este protocolo pode ser usado para comparar com precisão as populações diferentes dentro da medula óssea, ou a mesma população em diferentes modelos experimentais.

Introdução

As células-tronco hematopoiéticas (hscs) são autorenováveis, multipotentes e capazes de dar origem a todas as células do sangue^1,2. O metabolismo celular é um regulador chave da manutenção do HSC, juntamente com fatores transcricionais, sinais intrínsecos e o microambiente³^,⁴^,⁵. O controle adequado da função e qualidade mitocondrial é, portanto^,crítico para a manutenção do HSC^6,7.

O potencial de membrana mitocondrial (Δ, m) é um par....