Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi
Summary
Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.
Abstract
Elektroporasyon, hücre zarında geçici gözenekler oluşturmak ve geçirgenliğini artırmak için hücrelere elektriksel bir alanın uygulandığı ve böylece hücreye farklı moleküllerin sokulmasını sağlayan bir transfeksiyon yöntemidir. Bu yazıda, elektroporasyon ependymoglial hücrelere plazmidler tanıtmak için kullanılır, hangi yetişkin zebrabalığı telencephalon ventriküler bölge hattı. Bu hücrelerin bir kısmı kök hücre özelliklerini gösterir ve zebra balığı beyninde yeni nöronlar üretir; bu nedenle, nörogenez ve rejenerasyon rollerini belirlemek için davranışlarını incelemek esastır. Plazmidlerin elektroporasyon yoluyla piyasaya sürülmesi, tek bir ependymoglial hücrenin uzun süreli etiketlemesini ve izlenmesini sağlar. Ayrıca, Cre rekombinaz veya Cas9 gibi plazmidler tek ependymoglial hücrelere teslim edilebilir, bu da gen rekombinasyonunu veya gen düzenlemesini sağlar ve hücrenin otonom gen fonksiyonunu kontrollü, doğal Ortam. Son olarak, bu ayrıntılı, adım adım elektroporasyon protokolü tek ependymoglial hücrelerin çok sayıda içine plazmidlerin başarılı giriş elde etmek için kullanılır.
Introduction
Zebra balığı bir bıçak yarası yaralanması sonra beyin rejenerasyon incelemek için mükemmel hayvan modelleri vardır. Memelilere kıyasla, evrim merdiveninde, zebra balığı gibi daha az gelişmiş türler genellikle daha yüksek kurucu nörogenez ve yetişkin nöral kök hücre ikamet alanlarının daha yüksek oranlarını göstererek, sürekli olarak yeni nöronların yetişkin hayatında en beyin alanları. Bu özellik memelilere göre zebra balığının önemli ölçüde daha yüksek rejeneratif kapasitesi ile ilişkili görünüyor1, zebra balığı verimli bir şekilde en beyin hasarı modellerinde yeni nöronlar oluşturmak için olağanüstü bir potansiyele sahip olduğu gibi2, 3,4,5,6,7,8. Burada, zebra balığı telensefalon çalışılır, yetişkinlikte belirgin nörogenezi olan bir beyin alanı olduğu için. Erişkin nörogenezin bu bölgeleri yetişkin memeli beyninde nörojenik bölgelere homolog vardır9,10,11.
Zebrabalığı telensefalon bol nörojenik alanlar hücreleri veya ependymoglia hücreleri gibi radyal glia varlığı nedeniyle mevcuttur. Ependymoglial hücreler yerleşik yetişkin nöral kök hücreleri olarak hareket ve bozulmamış ve yenileyici beyin hem de yeni nöronların nesil sorumludur3,5. Soy izleme deneyleri ventriküler ependymoglia yaralanmatepki göstermiştir, daha sonra çoğalır ve lezyon sitesine göç yeni nöroblastlar üretmek5. Zebrabalığı telensefalon everted doğası nedeniyle, ependymoglial hücreler ventriküler yüzey hattı ve ventral ventriküler duvar inşa. Dorsal ventriküler duvar dorsal ependimal hücre tabakası ile oluşur (Şekil 1A). Daha da önemlisi, zebra balığı ependymoglia hem memeli radyal glia ve ependymal hücrelerin özelliklerini somutlaştırmak. Uzun radyal süreçler radyal glia hücrelerinin tipik bir özelliğidir, hücresel uzantıları ve sıkı kavşaklar ise (yanı sıra ventriküler pozisyonlar) ependimal hücrelerin tipik özellikleri12,13,14. Bu nedenle, bu hücreler ependymoglial hücreler olarak adlandırılır.
Rejenerasyon sırasında tek ependymoglial hücrelerin in vivo davranışını takip etmek için, güvenilir bir şekilde etiketlenmiş olması gerekir. Floresan mikroskopi için in vivo hücre etiketleme çeşitli yöntemler daha önce tarif edilmiştir, endojen muhabirler veya lipophilic boyalar gibi15. Bu yöntemler, elektroporasyon aksine, daha uzun süre ler gerektirebilir ve genellikle tek hücre etiketleme veya kalıcı uzun vadeli izleme imkanı sunmuyoruz. Elektroporasyon, ancak (tek hücre etiketleme yanı sıra), konak hücreiçine yeni DNA girme imkanı sunuyor. Ayrıca, hücrelere DNA transferi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, elektroporasyon en verimli yöntemlerden biri olduğu gösterilmiştir16,17,18,19.
Burada sunulan yetişkin zebrabalığı telencephalon tek ependymoglial hücreleri etiketleme amacıyla rafine edilmiş bir elektroporasyon protokolüdür. Bu protokol, uzun vadeli bir süre20 onları takip etmek veya hücre özerk bir şekilde belirli yolları işlemek için tek ependymoglial hücrelerin etiketleme sağlar21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu elektroporasyon protokolü tek tek ependymoglial hücreleri etiketleme güvenilir bir in vivo yöntemidir. Protokol nöronlar veya oligodendrocytes gibi diğer hücre tipleri etiketlemek için daha fazla adaptasyon gerekebilir. Başarılı etiketleme elde etmek için, farklı organizatörler içeren plazmidler kullanılabilir. Tavuk-beta aktin organizatörü, eF1alpha, CMV ve ubikitin organizatörü daha önce ependymoglia farklı transgenlerin ekspresyonu ve onların döl23sürücü için kull…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
James Copti’ye el yazmasının düzenlenmesi için özel teşekkürler. Ayrıca SFB 870 ve SPP “Integrative Analysis of Olfaction” ve SPP 1738 “Sinir sistemi gelişiminde kodlamayan RNA’ların ortaya çıkan rolleri” spp1757 tarafından Alman Araştırma vakfından (DFG) JN’ye yapılan finansmanı minnetle kabul ediyoruz. Glial heterojenlik”, ve Mükemmellik Stratejisi Münih Küme Sistemleri Nöroloji (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) çerçevesinde.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
Referências
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
