I denne undersøgelse beskriver vi en detaljeret procedure for TNBS-medieret intestinal fibrose, som udviser sammenlignelig Patofysiologi til Crohns fibrose. Vi diskuterer også denne tilgang i lyset af Rapamycin faciliterede hæmmende virkninger på tarm fibrose.
Der er udført signifikante undersøgelser for at forstå effektiv behandling af tarm fibrose. Men manglen på bedre kendskab til fibrose har hindret udviklingen af et forebyggende lægemiddel. Primært, at finde en egnet dyremodel er udfordrende i forståelsen af mekanismen af Crohns-associeret tarm fibrose patologi. Her har vi vedtaget en effektiv metode, hvor TNBS kemiske eksponering for mus rectums producerer betydeligt dyb ulceration og kronisk inflammation, og musene udvikler derefter kronisk tarm fibrose. Vi beskriver også en teknik, hvor en Rapamycin injektion viser inhiberende virkning på TNBS-medieret fibrose i musemodellen. For at vurdere den underliggende mekanisme af fibrose diskuterer vi metodisk en procedure til rensning af Cx3Cr1 + celler fra lamina propria af TNBS-behandlede og kontrolmus. Denne detaljerede protokol vil være nyttige for forskere, der undersøger mekanismen af fibrose og bane vejen for at finde en bedre terapeutisk opfindelse for Crohns-associeret tarm fibrose.
Dysregulering af immun homøostase i tarmen fører til patogene inflammation og har været almindeligt kendt for at forårsage inflammatorisk tarmsygdom (IBD)1,2. Tarm fibrose er en kronisk konsekvens af inflammatoriske tarmsygdomme (Ibd’er), såsom Crohns sygdom (CD)3. Den irreversible Patofysiologi af CD omfatter intestinal forsnævring eller stenose af fibrose, som begrænser behandlingsmuligheder, og uden medicin i øjeblikket er til rådighed, den eneste behandling er kirurgi. I sidste ende er udviklingen af effektive terapier til at imødegå uhensigtsmæssig inflammation er meget nødvendig for at studere mekanismen af CD, og dette vil føre os et skridt nærmere.
En række genetiske musemodeller er tilgængelige til at studere IBD herunder IL10 ko, SAMP/YIT og adoptiv CD45+RB høj celle overførsel til scid mus4,5,6. Her viser vi proceduren for TNBS-medieret fibrose i musemodel af CD, som er sammenlignelig med patologien af human Crohns fibrose. Den TNBS-induceret model har visse fordele. Denne model er teknisk enkel; sygdommens indtræden er hurtig, billig og kan i vid udstrækning anvendes til forskellige dyr (f. eks. mus, rotte og marsvin7). Samtidig administration af ethanol og tnb’er (2, 4, 6-trinitrobenzen sulfonsyre) beskadiger pludseligt tarm barrieren og udsætter tyktarms vævet protein til tnbs og fremkalder betydelige immunologiske reaktioner8,9. Gentagen eksponering af TNB’ER fører til en over reaktiv reparationsproces, der reagerer på inflammation og skader, og udvikler en fibrotisk reaktion i tarmen. Således, TNBS-induceret fibrose model tjener til at være en meget overbevisende model til at studere Crohns-associeret tarm fibrose.
Endvidere, mononukleiske fagocytter er de primære celler, der mægle den medfødte immunrespons på patogenesen og skade i tarmen10,11,12,13. For at belyse den cellulære mekanisme og for at etablere rollen som Cx3Cr1+ mononukleiske phagocytter i tnbs fibrose model, viser vi proceduren for rensning af mononukleske phagocytter. Analyse af Cx3Cr1+ celler er et vigtigt skridt for at vurdere de inflammatoriske markører og bestemme den samtidige mekanisme for tarm fibrose. Kollektivt, denne detaljerede procedure for TNBS fibrose vil være nyttigt at forklare de cellulære mekanismer af tarm fibrose.
Sårheling eller vævsreparation er en tæt reguleret biologisk proces17. Under vævsskade med en kemisk, mekanisk og infektion tilstand, en inflammatorisk respons udløser vævs reparationsprocessen. Men en dysreguleret og patologisk inflammatorisk respons fører til udvikling af ardannelse eller en fibrotisk reaktion, som kan forringe vævs reparationsfunktionen9,18,19. Her viser vi proceduren for den TNBS-inducerede fibrose dyremodel, som i betydelig grad deler Patofysiologi med human Crohns sygdom. Efterfølgende inokulering af TNBS kemisk udsættelse for beskadigelse af muse epitelet forårsager dybe sår og inducerer fibroseudvikling. Med en pålidelig, lav pris, og hurtig induktion af sygdommen debut, denne metode er bredt accepteret af flere forskningsgrupper involveret i undersøgelser for vævsskade, transmural inflammation og tarm-hjerne akse.
For at implementere TNBS fibrose-modellen med succes er der flere vigtige trin. For eksempel, tilstrækkelig dosering og timing af TNBS administration er meget vigtige. En 6-8-ugers TNBS inokulation giver mulighed for dyb vævs ulceration og anbefales stærkt til kroniske fibrotiske undersøgelser. Outcoming afføring fra mus og retrograd refleks af inokulerede TNB’ER er to store problemer, som kan resultere i levering af variable doser til mus. Forsigtigt tryk nær musene endetarmen kan hjælpe med at frigive afføring før administration af tnbs. Holde hovedet af dyret ned i et par sekunder dramatisk hjælper med at stoppe reverse refluks af tnbs. Holde musene i et bur, placere buret på en varmepude, og give musene med Napa nektar kunne også være nyttige strategier for at forhindre høj dødelighed.
Her diskuterer vi også tarmbetændelse under TNBS fibrose og deres indvirkning på fibrotisk respons. MTOR/autophagy rolle er stort set impliceret i intestinal homøostase og i IBD patogenesen20,21. Vi identificerede, at mTOR/autophagy signalering er afgørende for at modutere pro-inflammatoriske reaktioner fra IL-23 og IL1β cytokiner fra Cx3Cr1+ mononukleiske phagocytter, der påvirker Pro-FIBROTISK Il-23/Il-22 akse (figur 3A)9 . Derved er rensning af enkelt Cx3Cr1+ mononukleare celler til immunoproarkivering og genekspression et kritisk trin i modellen. Vi diskuterer i detaljer protokollen til isolering af lamina propria og giver rensningsproceduren for Cx3Cr1+ mononukleare celler ved hjælp af magnetiske perler.
Kollektivt, på trods af tilstedeværelsen af genetiske og spontane modeller for Crohns sygdom, TNBS-colitis er fortsat et potent værktøj til at studere immuno-patogenesen af CD og har potentiale til at evaluere Crohns fibrose behandlinger. Den største begrænsning ved brug af kemisk inducerede fibrose modeller som TNBS er chancen for stor variation fra bruger til bruger og muligheden for afvigende data. En stikprøvestørrelse på 5-8 dyr pr. gruppe sammen med større brugeroplevelse kan øge konsistensen af modellen. Men at finde en passende genetisk model forårsager spontan Crohns fibrose er og vil altid være berettiget.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.) og Crohns & colitis Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
DAPI | SIGMA | D9542 | |
DMEM | Corning | 10013-CV | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
TNBS | Sigma | 92823 | |
Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |