I denne studien beskriver vi en detaljert prosedyre av TNBS-mediert tarm fibrose, som utstillinger sammenlignbare patofysiologi til Crohns fibrose. Vi diskuterer også denne tilnærmingen i lys av Rapamycin tilrettelagt hemmende effekter på intestinal fibrose.
Betydelige studier har blitt gjennomført for å forstå effektiv forvaltning av tarm fibrose. Mangelen på bedre kunnskap om fibrose har imidlertid hindret utviklingen av et forebyggende medikament. Primært finne en passende dyremodell er utfordrende å forstå mekanismen av Crohns-assosiert intestinal fibrose patologi. Her vedtok vi en effektiv metode der TNBS kjemisk eksponering for mus rectums produserer betydelig dypt sårdannelse og kronisk betennelse, og musene deretter kronisk utvikle intestinal fibrose. Også beskriver vi en teknikk der en Rapamycin injeksjon viser hemmende effekter på TNBS-mediert fibrose i muse modellen. For å vurdere den underliggende mekanismen for fibrose diskuterer vi en prosedyre for rensing av Cx3Cr1 + celler fra den lamina propria til TNBS-behandlede og kontroll mus. Denne detaljerte protokollen vil være nyttig for forskere som undersøker mekanismen for fibrose og legge banen for å finne en bedre terapeutisk oppfinnelse for Crohns-assosiert intestinal fibrose.
Feilregulering av immun homeostase i tarmen fører til sykdomsfremkallende betennelse og har vært viden kjent for å forårsake inflammatorisk tarmsykdom (IBD)1,2. Intestinal fibrose er en kronisk konsekvens av inflammatoriske tarm sykdommer (IBDs), for eksempel Crohns sykdom (CD)3. Den irreversible patofysiologi av CD inkluderer intestinal striktur eller stenose av fibrose, som begrenser behandlingstilbud, og uten medisiner tilgjengelig for øyeblikket, den eneste behandlingen er kirurgi. Til syvende og sist er utviklingen av effektive terapier for å motvirke upassende betennelser mye som trengs for å studere mekanismen av CD, og dette vil føre oss et skritt nærmere det.
En rekke genetiske musemodeller er tilgjengelig for å studere IBD inkludert IL10 ko, SAMP/YIT og adoptiv CD45+RB høy celle overføring til SCID mus4,5,6. Her viser vi fremgangsmåten for TNBS-mediert fibrose i musen modell av CD, som kan sammenlignes med patologi av humant Crohns fibrose. TNBS-indusert modellen har visse fordeler. Denne modellen er teknisk enkel; sykdom utbruddet er rask, billig, og kan mye brukes i forskjellige dyr (f. eks, mus, rotte og marsvin7). Samtidig administrering av etanol og TNBS (2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonsyrer acid) skader tarm barrieren og eksponerer kolon tissue protein for å TNBS og lokke fram betydelige Immunologic svar8,9. Gjentatt eksponering av TNBS fører til en overreactive reparasjonsprosess som responderer på inflammasjon og skader, og utvikler en antifibrotiske reaksjon i tarmen. Således, TNBS-indusert fibrose modellen tjener til å være en svært overbevisende modell for å studere Crohns-assosiert intestinal fibrose.
Videre mononukleære phagocytes er de primære cellene som megle i medfødt immunrespons til patogenesen og skade i tarmen10,11,12,13. For å belyse den cellulære mekanismen og å etablere rollen til Cx3Cr1+ mononukleære PHAGOCYTES i TNBS fibrose modellen, viser vi prosedyren for rensing av mononukleære phagocytes. Analyse av Cx3Cr1+ celler er et viktig skritt for å vurdere den inflammatoriske markører og bestemme samtidig mekanisme for intestinal fibrose. Kollektivt, denne detaljerte prosedyren for TNBS fibrose vil være nyttig å forklare cellulære mekanismer av intestinal fibrose.
Sår helbredelse eller reparasjon av vev er en strengt regulert biologisk prosess17. Under vevsskade med en kjemisk, mekanisk og infeksjon tilstand, utløser en inflammatorisk respons vevet reparasjonsprosessen. Imidlertid fører en dysregulated og patologisk inflammatorisk respons til utvikling av arrdannelse eller en antifibrotiske reaksjon, noe som kan svekke vevs reparasjonsfunksjonen9,18,19. Her viser vi prosedyren for TNBS-indusert fibrose dyr modell, som i betydelig grad aksjer patofysiologi med humant Crohns sykdom. Påfølgende inoculation av TNBS kjemisk eksponering for skade musen epitel forårsaker dyp ulcerasjon og induserer fibrose utvikling. Med en pålitelig, lav kostnad, og rask induksjon av sykdomsutbruddet, er denne metoden allment akseptert av flere forskningsgrupper involvert i studier for vevsskade, transmuralt betennelser og gut-hjerne-aksen.
For å kunne implementere TNBS fibrose modellen, er det flere viktige trinn. For eksempel, tilstrekkelig dosering og timing av TNBS administrasjon er svært viktig. En 6-8-ukers TNBS-inoculation gir dyp vevs sår og er sterkt anbefalt for kroniske antifibrotiske-studier. Resultatet krakk fra mus og retrograd refleks av inokulert TNBS er to store problemer, noe som kan føre til levering av variable doser til mus. Lett trykk nær mus endetarmen kan bidra til å frigjøre avføring før TNBS administrasjon. Holding hodet av dyret ned i noen sekunder dramatisk bidrar til å stoppe Reverse reflux av TNBS. Holde mus i et bur, plassere buret på en varmepute, og gi mus med Napa nektar kan også være nyttige strategier for å forebygge høy dødelighet.
Her diskuterer vi også tarm betennelsen under TNBS fibrose og deres innvirkning på antifibrotiske respons. mTOR/autofagi rolle er grovt innblandet i tarm homeostase og i IBD patogenesen20,21. Vi identifiserte at mTOR/autofagi signalering er avgjørende for å modulere Pro-inflammatorisk svar fra IL-23 og IL1β cytokiner fra Cx3Cr1+ mononukleære phagocytes som påvirker Pro-antifibrotiske Il-23/Il-22 aksen (Figur 3A)9 . Derved er rensing av enkelt Cx3Cr1+ mononukleære-celler for immunoprofiling og genuttrykk et kritisk trinn i modellen. Vi diskuterer i detalj protokollen for å isolere lamina propria og gi rensing prosedyre for Cx3Cr1+ mononukleære celler ved hjelp av magnetiske perler.
Kollektivt, til tross for tilstedeværelsen av genetiske og spontane modeller for Crohns sykdom, TNBS-kolitt er fortsatt et potent verktøy for å studere Immuno-patogenesen av CD og har potensial til å evaluere Crohns fibrose behandlinger. Den store begrensningen for å bruke kjemisk indusert fibrose modeller som TNBS er sjansen for høy variasjon fra bruker til bruker og muligheten for outliers i dataene. En utvalgsstørrelse på 5-8 dyr per gruppe sammen med større brukeropplevelse kan øke konsistens i modellen. Men å finne en passende genetisk modell forårsaker spontan Crohns fibrose er og vil alltid være berettiget.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), og Crohns & kolitt Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (RM).
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
DAPI | SIGMA | D9542 | |
DMEM | Corning | 10013-CV | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
TNBS | Sigma | 92823 | |
Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |