I denna studie beskriver vi ett detaljerat förfarande av TNBS-medierad intestinal fibros, som uppvisar jämförbar patofysiologi till Crohns fibros. Vi diskuterar också denna strategi mot bakgrund av rapamycin underlättade hämmande effekter på intestinal fibros.
Signifikanta studier har utförts för att förstå effektiv hantering av intestinal fibros. Bristen på bättre kunskap om fibros har dock hindrat utvecklingen av en förebyggande drog. I första hand, att hitta en lämplig djurmodell är utmanande i förståelsen av mekanismen för Crohns-associerad intestinal fibros patologi. Här, vi antog en effektiv metod där TNBS kemisk exponering för möss rectumsen producerar betydligt djupa sår och kronisk inflammation, och möss sedan kroniskt utveckla intestinal fibros. Vi beskriver också en teknik där en rapamycin injektion visar hämmande effekter på TNBS-medierad fibros i musmodellen. För att bedöma den bakomliggande mekanismen för fibros, diskuterar vi metodiskt ett förfarande för rening av Cx3Cr1 + celler från lamina propria av TNBS-behandlade och kontroll möss. Detta detaljerade protokoll kommer att vara till hjälp för forskare som undersöker mekanismen för fibros och bana väg för att hitta en bättre terapeutisk uppfinning för Crohns-associerad intestinal fibros.
Dysreglering av immun homeostas i tarmen leder till patogena inflammation och har varit vida känt att orsaka inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)1,2. Intestinal fibros är en kronisk följd av inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs), såsom Crohns sjukdom (CD)3. Den oåterkalleliga patofysiologin av CD inkluderar intestinal striktur eller stenos av fibros, som begränsar behandlingsalternativ, och utan mediciner för närvarande finns, den enda behandlingen är kirurgi. I slutändan, utvecklingen av effektiva terapier för att motverka olämplig inflammation är mycket som behövs för att studera mekanismen för CD, och detta kommer att leda oss ett steg närmare det.
En mängd olika genetiska musmodeller finns att studera IBD inklusive IL10 ko, SAMP/YIT och adoptiv CD45+RB High cell transfer till scid möss4,5,6. Här visar vi proceduren för TNBS-medierad fibros i musmodellen av CD, som är jämförbar med patologi av mänsklig Crohns fibros. Den TNBS-inducerad modellen har vissa fördelar. Denna modell är tekniskt enkel; sjukdomsdebut är snabb, billig, och kan i stor utsträckning användas i olika djur (t. ex., mus, råtta och marsvin7). Samtidig administrering av etanol och TNBS (2, 4, 6-Trinitrobensen sulfonsyra) abrupt skadar tarmbarriären och exponerar kolon vävnad protein till TNBS och framkalla betydande immunologiska svar8,9. Upprepad exponering av TNBS leder till en overreactive reparationsprocessen reagera på inflammation och skada, och utvecklar en fibrotisk reaktion i tarmen. Således, TNBS-inducerad fibros modell tjänar till att vara en mycket övertygande modell för att studera Crohns-associerade intestinal fibros.
Dessutom, mononukleära fagocyter är de primära celler som medla den medfödda immunsvaret till patogenes och skada i tarmen10,11,12,13. För att belysa den cellulära mekanismen och för att fastställa den roll som Cx3Cr1+ mononukleära fagocyter i TNBS fibros modell, visar vi förfarandet för rening av mononukleära fagocyter. Analys av Cx3Cr1+ celler är ett viktigt steg för att bedöma de inflammatoriska markörer och bestämma samtidig mekanism för intestinal fibros. Kollektivt, detta detaljerade förfarande för TNBS fibros kommer att vara till hjälp för att förklara cellulära mekanismer av intestinal fibros.
Sårläkning eller vävnads reparation är en tätt reglerad biologisk process17. Under vävnadsskada med en kemisk, mekanisk och infektion tillstånd, en inflammatorisk reaktion utlöser vävnads reparationsprocessen. Emellertid, en dysreglerad och patologiska inflammatoriska svar leder till att utveckla ärrbildning eller en fibrotisk reaktion, som kan försämra vävnads reparationsfunktionen9,18,19. Här visar vi proceduren för TNBS-inducerad fibros djurmodell, som signifikant delar patofysiologi med mänsklig Crohns sjukdom. Successiva inympning av TNBS kemisk exponering för skador på mus epitel orsakar djupa sår och inducerar fibros utveckling. Med en pålitlig, låg kostnad, och snabb induktion av sjukdomsdebut, denna metod är allmänt accepterat av flera forskargrupper inblandade i studier för vävnadsskada, transmural inflammation och Gut-hjärn-axeln.
För att framgångsrikt implementera TNBS fibros-modellen finns det flera viktiga steg. Till exempel, adekvat dosering och timing av TNBS administration är mycket viktiga. En 6-8-veckors TNBS inympning tillåter djup vävnad sår och rekommenderas starkt för kroniska fibrotiska studier. Utkommande avföring från möss och retrograd reflex av inokulerade TNBS är två stora problem, vilket kan resultera i leverans av variabla doser till möss. Milt tryck nära möss ändtarmen kan hjälpa frisättning avföring innan TNBS administration. Håller huvudet av djuret ner i några sekunder dramatiskt hjälper till att stoppa omvänd reflux av TNBS. Att hålla möss i en bur, placera buren på en värme pad, och ge möss med Napa nektar kan också vara användbara strategier för att förhindra hög dödlighet.
Här, vi diskuterar också tarmen inflammation under TNBS fibros och deras inverkan på fibrotiska svar. mTOR/autofagi roll är i stort sett inblandad i intestinal homeostas och i IBD patogenes20,21. Vi identifierade att mTOR/autofagi signalering är avgörande för att modulera pro-inflammatoriska reaktioner från IL-23 och IL1β cytokiner från Cx3Cr1+ mononukleära fagocyter som påverkar Pro-FIBROTISK Il-23/Il-22-axeln (figur 3A)9 . Därmed är renande Single Cx3Cr1+ mononukleära celler för immunoprofilering och genuttryck ett kritiskt steg i modellen. Vi diskuterar i detalj protokollet för att isolera lamina propria och ge Reningsproceduren för Cx3Cr1+ mononukleära celler med hjälp av magnetiska pärlor.
Kollektivt, trots närvaron av genetiska och spontana modeller för Crohns sjukdom, TNBS-kolit är fortfarande ett potent verktyg för att studera Immuno-patogenesen av CD och har potential att utvärdera Crohns fibros behandlingar. Den största begränsningen av användning av kemiskt inducerad fibros modeller såsom TNBS är risken för hög variation från användare till användare och möjligheten att extremvärden i data. En urvalsstorlek på 5-8 djur per grupp tillsammans med större användarupplevelse kan öka konsekvensen i modellen. Emellertid, att hitta en lämplig genetisk modell som orsakar spontan Crohns fibros är och kommer alltid att vara motiverad.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), och Crohns & kolit Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
DAPI | SIGMA | D9542 | |
DMEM | Corning | 10013-CV | |
DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
TNBS | Sigma | 92823 | |
Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |