عدوى السالمونيلا المزمنة الناجمة عن التليف المعوي

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج الماوس من التليف المعوي الذي يحركه السالمونيلا الذي يشبه السمات المرضية الرئيسية لمرض كرون بما في ذلك التهاب عبر الجدارية والتليف. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم العوامل المضيفة التي تغير النتائج الليفية باستخدام الفئران المتحولة التي تم الحفاظ عليها على خلفية وراثية C57Bl/6.

Abstract

تليف الأنسجة يتميز بالتراكم المرضي للمصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين هو نتيجة للالتهاب المستمر وإصلاح dysregulated. في مرض الأمعاء الالتهابي (IBD)، يؤدي التليف إلى تشكيلات تضيق متكررة لا يوجد علاج فعال لها سوى الاستئصال الجراحي. بسبب ظهورها في وقت متأخر، والعمليات التي تدفع التليف هو أقل دراسة وغير معروف إلى حد كبير. ولذلك، فإن المضاعفات الليفية تمثل تحديا كبيرا في IBD. في هذا البروتوكول، يتم وصف نموذج قوي في الجسم الحي من التليف المعوي حيث العقدية قبل العلاج من الفئران C57Bl/6 تليها اللقاحات عن طريق الفم مع الصف لقاح السالمونيلا Typhimurium ΔAroA متحولة يؤدي إلى الاستعمار المسبب المستمر و التليف من cecum. منهجيات إعداد S. يتم شرح قياس الأحمال المسببة للأمراض في السيكوم والطحال، وتقييم ترسب الكولاجين في الأنسجة المعوية. هذا النموذج المرض التجريبي مفيد لفحص العوامل المضيفة التي إما تعزيز أو تفاقم التليف المعوي الشبيه بالقرص المضغوط.

Introduction

التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) هما الشكلان الرئيسيان من IBD ويتميزان بالاضطرابات الالتهابية المزمنة والانتكاسية في الجهاز الهضمي ^1،2. هذه الاضطرابات لها تأثير كبير على نوعية حياة المرضى. وتشمل أعراض IBD آلام البطن والإسهال والغثيان وفقدان الوزن والحمى والتعب³. وقد حددت الدراسات الحديثة العوامل الوراثية والبيئية التي تسهم في مسببات الأمراض؛ ويعتقد أن عوامل الخطر هذه تسهم في تعطيل الحاجز الظهاري مما يؤدي إلى نقل أو الإفراط في المستضدات الإنارة⁴. ونتيجة لذلك ، فإن هذا يبدأ استجابة التهابية شاذة للنباتات commensal بوساطة الخلايا المناعية المعوية⁴. قد تمتد ملامح المضاعفات المرتبطة بـ IBD إلى مواقع خارج الجهاز الهضمي التي تؤثر على مختلف الأجهزة بما في ذلك المفاصل والجلد والكبد^1و2. وتشمل السمات المميزة للجامعة الوسطى التهاب حاد ومنتشر عادة المترجمة في القولون¹. أمراض المرض يؤثر على الغشاء المخاطي وsubmucosa من الأمعاء مما أدى إلى تقرحات الغشاء المخاطي السطحي¹. وعلى النقيض من ذلك، يمكن أن يؤثر القرص المضغوط على أي جزء من الجهاز الهضمي على الرغم من أن الأدلة على المرض توجد عادة في القولون واللفائفي القاصي². وعلاوة على ذلك، فإن التهاب في القرص المضغوط هو transmural، مما يؤثر على جميع طبقات جدار الأمعاء².

العديد من الجينات حساسية IBD التي تم تحديدها تشير إلى أن خلل تنظيم الحاجز الظهاري أو الحصانة هي العوامل الحاسمة في تطور المرض⁵. تم العثور على الطفرات في مجال القلة النيوكليوتيدات 2 (NOD2) التي أعربت عنها الخلايا الأحادية أن تكون مرتبطة بزيادة قابلية للإصابة بالقرص المضغوط; هذا يسلط الضوء على وجود صلة بين الكشف المناعي الفطري المتغير للمكونات البكتيرية والمرض⁶. وقد كشفت دراسات الارتباط على نطاق الجينوم (GWAS) أحدث مسارات إضافية يحتمل أن تشارك في مسببات الأمراض من IBD بما في ذلك الاختلافات الوراثية في: STAT1، NKX2-3، IL2RA، المسارات المعتمدة IL23R مرتبطة الحصانة التكيفية، MUC1، MUC19، وPTGER4 في صيانة حاجز الأمعاء، وATG16Lبوساطة autophagy^7،8،9. في حين أن هذه الدراسات الوراثية القائمة على السكان قد عززت فهمنا للIBD, الأليلات قابلية وحدها من المرجح أن تكون غير كافية في بدء وإدامة الأمراض المزمنة³. وقد ارتبطت عوامل أخرى غير وراثية بما في ذلك التعديلات في تكوين ميكروبيوم الأمعاء والحد من التنوع مع التهاب الأمعاء. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كان عسر الهضم الأمعاء يسبق أو هو نتيجة لعسر تنظيم الاستجابات المناعية³. على الرغم من أن مسببات IBD لا تزال غير واضحة، وقد تعزز فهمنا لمسببات المرض من قبل نماذج الماوس التجريبية من التهاب الأمعاء^10،11. هذه النماذج بشكل فردي لا تمثل تماما تعقيد المرض البشري، ولكنها قيمة لتوضيح المسارات المرضية الفسيولوجية التي يمكن أن تكون ذات صلة IBD وللتحقق من الاستراتيجيات العلاجية المؤقتة^{10، 11}. نماذج الماوس هذه تعتمد عادة على بدء الالتهاب عن طريق الحث الكيميائي أو العدوى، ونقل الخلايا المناعية، أو التلاعب الوراثي. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما تنطوي هذه الاستراتيجيات على اضطرابات في السلامة الظهارية أو تعديل المناعة الفطرية أو التكيفية.

السالمونيلا المعوية هي مسببات الأمراض المعوية التي يمكن أن تصيب البشر والفئران. بعد الابتلاع، السالمونيلا يمكن استعمار الأمعاء عن طريق الغزو المباشر للظهارة، والخلايا M، أو مستضد تقديم الخلايا¹². الفئران المصابة شفويا مع S. ينتج عن التيفيمويوم في استعمار المواقع النظامية في المقام الأول مثل الطحال والغدد الليمفاوية المساريقية مع وفرة منخفضة نسبيا في الجهاز الهضمي¹². ومع ذلك ، فإن المعالجة المسبقة للفئران مع العقديات تعزز كفاءة استعمار السالمونيلا للأمعاء عن طريق تقليل الآثار الوقائية للميكروبيوتا^{العادية 13}. وتشمل السمات المرضية لهذا النموذج تعطيل أو تقرح الحاجز الظهاري، وتوظيف المحببات، وذمة شديدة¹³. بدلا من ذلك، العدوى مع لقاح الصف S. تيفيميوم ΔAroA متحولة يؤدي إلى الاستعمار المزمن من cecum والقولون الذي يستمر حتى اليوم 40 بعد العدوى¹⁴. الـ S. سلالة تيفيمواليوم ΔAroA لديه عيب في التركيب الحيوي للأحماض الأمينية العطرية. وهذا يجعل سلالة متحولة avirulent ويمكن استخدامها كلقاح فعال للغاية¹⁵. العدوى عن طريق الفم في الفئران يؤدي إلى استجابة التهابية Th1- و Th17-السيتوكين المرتبطة، وإعادة عرض الأنسجة واسعة النطاق، وترسب الكولاجين. ويرتبط علم أمراض الأنسجة مع مستويات مرتفعة من العامل الليفي الموالية مثل TGF-β1, CTGF, ومنتدى إدارة الإنترنت¹⁴. تندب الليفي عبر جدارية ذكرت في هذا النموذج تذكرنا تشكيلات التضيق غالبا ما لوحظ في IBD. الحث من التليف من قبل السالمونيلا يتطلب ضراوة ترميز من قبل جزر السالمونيلا المسببة للأمراض (SPI)-1 و 2 ¹². الأهم من ذلك، هذا S. نموذج العدوى Tymphimurium ΔAroA هو نظام مفيد لدراسة الاستجابات الليفية في الفئران متحولة الحفاظ على خلفية C57/Bl6. سلالة C57/Bl6 حساسة للغاية لS. عدوى التيفييومويوم SL1344 بسبب طفرة فقدان الوظيفة في الجينات ترميز بروتين الضامة الطبيعي المرتبط بالمقاومة (NRAMP)-1^16,17. لقد وجدنا أن IL-17A وRORα تعتمد على الخلايا الليمفاوية الفطرية هي المساهمين المهمين في مسببات الأمراض في هذا النموذج¹⁸.

ومن المضاعفات الرئيسية للقرص المضغوط هو الترسيب غير المنظم والمفرط للمصفوفة خارج الخلية (ECM) بما في ذلك الكولاجين^2،19. على الرغم من أن الجهاز الهضمي لديه قدرة عالية نسبيا لتجديد, تندب الليفي يمكن أن تنشأ بسبب استجابات التئام الجروح التي لم تحل التي ترتبط مع التهاب مزمن وحاد^20,21. في مؤتمر نزع السلاح، وهذا يؤدي إلى آثار ضارة على بنية الأنسجة مما يؤدي إلى ضعف كبير في الجهاز^21،22. الطبيعة عبر جدارية للالتهاب لوحظ في مؤتمر نزع السلاح في نهاية المطاف تسبق سماكة جدار الأمعاء المرتبطة تضيق أعراض أو تشكيل تضيق²¹. حوالي ثلث مرضى القرص المضغوط تتطلب استئصال الأمعاء لهذه المضاعفات²². لا توجد علاجات فعالة مضادة للليفي في IBD بالنظر إلى أن استخدام مثبطات المناعة مثل أزاثيوبرين أو مضادات TNFα البيولوجيا ليس لها تأثير أو خفضت فقط بشكل متواضع متطلبات التدخلات الجراحية^19،23 . في حين يعتقد أن التليف هو نتيجة للالتهاب المزمن، ويعتقد أن الخلايا من أصل mesenchymal مثل الخلايا الليفية وpericytes لتكون المصادر الخلوية الأولية من ECM في تندب الليفي^21،24. S المزمنة. عدوى تيفيموريوم ΔAroA هو نموذج ماوس قوي من التليف المعوي الذي يمكن أن يقدم رؤى في مسببات الأمراض من الميزات الشبيهة بالقرص المضغوط.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات في جامعة كولومبيا البريطانية. 1. إعداد الثقافات السالمونيلا التيفيموريوم ΔAroA لاللقاحات عن طريق الفم من الفئران من مخزون الجلسرين المجمد من S. Typhimurium ΔAroA، وإعداد لوحة خط باستخدام أجار LB تح?…

Representative Results

علاج العقديات تليها العدوى عن طريق الفم مع S. التيفيموريوم ΔAroA يؤدي إلى التهاب معوي قوي والتليف وخاصة في cecum(الشكل 1). يمكن استرداد أعباء مسببات الأمراض النموذجية من 108 إلى 109 CFU لكل 1 غرام من cecum و 104 CFU لكل 1 غرام من الطحال من الحيوانات المصابة(ا…

Discussion

وقد تعزز فهمنا لمسببات الأمراض من IBD إلى حد كبير من قبل نماذج الماوس من التهاب الأمعاء. وعلى الرغم من أن هذه النماذج الفردية لا تُلخص جميع سمات المرض البشري المعقد والمتعدد العوامل، فقد كانت مفيدة في تحديد السمات الرئيسية لتطور المرض. لا تزال القيود الليفية المرتبطة بـ IBD حاجة سريرية كبيرة …

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM