Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal

Summary

Este protocolo descreve um modelo do rato da fibrose intestinal conduzida salmonela que se assemelha a características patológicas chaves de Crohn ‘ doença de s que inclui a inflamação e a fibrose transmural. Este método pode ser usado para avaliar os fatores hospedeiros que alteram os desfechos fibróticos usando camundongos mutantes mantidos em um fundo genético C57Bl/6.

Abstract

A fibrose tecidual caracterizada pelo acúmulo patológico de matriz extracelular, como o colágeno, é o desfecho de inflamação persistente e reparo disregulado. Na doença inflamatória intestinal (DII), a fibrose leva a formações críticas recorrentes para as quais não há nenhuma terapia eficaz além da ressecção cirúrgica. Devido ao seu início tardio, os processos que impulsionam a fibrose são menos estudados e em grande parte desconhecidos. Conseqüentemente, as complicações fibrótica representam um desafio principal no IBD. Neste protocolo, um modelo in vivo robusto de fibrose intestinal é descrito em que o pré-tratamento com estreptomicina de camundongos C57Bl/6 seguidos por gavagem oral com o mutante de Salmonella typhimurium ΔAroA de grau vacinal leva à colonização persistente do patógeno e fibrose do cálio. Metodologias para a preparação de S. O δaroa de typhimurium para a inoculação, quantificando cargas do micróbio patogénico no ceco e no spleen, e avaliando a deposição do colagénio em tecidos intestinais é explicado. Este modelo de doença experimental é útil para examinar os fatores hospedeiros que aumentam ou exacerbam a fibrose intestinal semelhante a um CD.

Introduction

A colite ulcerosa (UC) e a doença de Crohn (DC) são as duas principais formas de DII e são caracterizadas como distúrbios inflamatórios crônicos e recidivantes do trato gastrointestinal ^1,2. Estes distúrbios têm um grande impacto na qualidade de vida dos pacientes. Os sintomas de DII incluem dor abdominal, diarreia, náuseas, perda de peso, febre e fadiga³. Estudos recentes identificaram fatores genéticos e ambientais que contribuem para a patogênese da doença; Pensa-se que tais fatores de risco contribuem para a ruptura da barreira epitelial, resultando na translocação ou Superamostragem de antígenos luminais⁴. Como consequência, isso inicia uma resposta inflamatória aberrante à flora comensal mediada pelas células imunológicas intestinais⁴. As características das complicações associadas ao IBD podem estender-se a sítios além do trato gastrointestinal que afetam vários^{órgãos, incluindo}articulações, pele e fígado^1,2. As características da UC incluem inflamação severa e difusa tipicamente localizada no cólon¹. A patologia da doença afeta a mucosa e a submucosa do intestino, resultando em ulcerações mucosas superficiais¹. Por outro lado, a DC pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal, embora a evidência de doença seja comumente encontrada no cólon e no íleo distal². Além disso, a inflamação em CD é transmural, afetando todas as camadas da parede intestinal².

Vários genes de suscetibilidade ao IBD que foram identificados indicariam que a desregulação da barreira epitelial ou imunidade são contribuintes críticos para a progressão da doença⁵. As mutações no domínio 2 do oligomerização do nucleotide (NOD2) expressada por monócitos foram encontradas para ser associadas com a susceptibilidade aumentada ao CD; Isto destaca uma ligação entre a deteção imune inata alterada de componentes bacterianos e a doença⁶. Os estudos mais recentes da associação do genoma-largo (GWAS) revelaram as vias adicionais envolvidas potencial na patogénese de IBD que incluem variações genéticas em: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R caminhos dependentes ligada à imunidade adaptativa , MUC1, MUC19, e PTGER4 na manutenção da barreira intestinal, e autofagia mediada por ATG16L^7,8,9. Embora estes estudos de genética de base populacional tenham melhorado a nossa compreensão do IBD, os alelos de susceptibilidade sozinhos são provavelmente insuficientes para iniciar e sustentar a doença crónica³. Outros fatores não genéticos, incluindo alterações na composição do microbioma intestinal e redução da diversidade, têm sido associados à inflamação intestinal. No entanto, não está claro se a disbiose intestinal precede ou é a consequência de respostas imunes disreguladas³. Embora a etiologia do IBD permaneça obscura, nossa compreensão da patogénese da doença foi aumentada por modelos experimentais do rato da inflamação intestinal^10,11. Esses modelos individualmente não representam plenamente a complexidade da doença humana, mas são valiosos para elucidar as vias fisiopatológicas que podem ser relevantes para o DII e para a validação de estratégias terapêuticas tentativas^10, o ¹¹. Tais modelos de mouse tipicamente dependem do início da inflamação por indução química ou infecção, transferência de células imunes, ou manipulação genética. Além disso, essas estratégias geralmente envolvem perturbações na integridade epitelial ou modulação da imunidade inata ou adaptativa.

Salmonella enterica Sorovares são patógenos intestinais que podem infectar humanos e camundongos. Após a ingestão, Salmonella pode colonizar o intestino por invasão direta de epithelia, células M, ou antígeno apresentando células¹². Camundongos infectados por via oral com S. Typhimurium conduz à colonização primeiramente de locais sistemáticos tais como o spleen e os nós de linfa mesentérica com abundância relativamente baixa no intervalo do soldado¹². No entanto, o pré-tratamento de camundongos com estreptomicina aumenta a eficiência da colonização de Salmonella do intestino diminuindo os efeitos protetores do hospedeiro da microbiota normal¹³. As características patológicas deste modelo incluem o rompimento ou o ulceração da barreira epithelial, do recrutamento do granulocyte, e do edema severo¹³. Alternativamente, a infecção com a vacina grau S. O mutante de typhimurium δaroa conduz à colonização crônica do ceco e dos dois pontos que persiste até o dia 40 após a infecção¹⁴. O S. A estirpe de typhimurium ΔAroA tem um defeito na biossíntese de aminoácidos aromáticos; Isto rende a estirpe do mutante avirulent e pode ser utilizado como uma vacina altamente eficaz¹⁵. A infecção oral nos ratos conduz a uma resposta inflamatório associada Th1-e Th17-cytokine, a remodelação extensiva do tecido, e ao depósito do colagénio. A patologia tecidual está associada a níveis elevados de fator pró-fibrótico, como TGF-β1, CTGF e IGF¹⁴. A cicatriz fibrótica transmural relatada neste modelo é reminiscente das formações de estenose observadas frequentemente em IBD. A indução de fibrose por Salmonella requer virulência codificada pelas ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPI)-1 e 2 ¹². É importante, este S. O modelo de infecção por tymphimurium ΔAroA é um sistema útil para o estudo de respostas fibróticas em camundongos mutantes mantidos em um fundo C57/Bl6. A cepa C57/Bl6 é extremamente sensível a S. Infecção de typhiumurim SL1344 devido a uma mutação da perda–função no gene que codifica a proteína de macrófago resistência-associada natural (nramp)-1^16,17. Nós encontramos que as pilhas lymphoid inata Il-17a e rorα-dependentes são contribuintes importantes à patogénese neste modelo¹⁸.

Uma complicação importante do CD é o depósito disregulado e excessivo da matriz extracelular (ECM) que inclui o colagénio^2,19. Embora o trato gastrointestinal tenha uma capacidade relativamente alta de regeneração, a cicatrização fibrótica pode surgir devido a respostas de^{cicatrização deferidas não resolvidas}que estão associadas à inflamação crônica e severa^20,21. Em CD, isso resulta em efeitos deletérios na arquitetura tecidual, levando a comprometimento significativo^{de órgãos}21^,22. A natureza transmural da inflamação observada em CD, em última análise, precede o espessamento da parede intestinal associada à estenose sintomática ou à formação de estenoses²¹. Cerca de um terço dos pacientes com CD necessitam de ressecção intestinal para esta complicação²². Não existem terapias antifibróticas efetivas no IBD, dado que o uso de imunossupressores como a azatioprina ou antitnfα biológica não tem impacto ou apenas reduziu modestamente a exigência de intervenções cirúrgicas^19,20 . Quando a fibrose for pensada ser a conseqüência da inflamação crônica, as pilhas da origem mesenquimais tais como fibroblasto e pericitos são pensadas para ser as fontes celulares preliminares do ECM em cicatrizes fibrótica^21,24. Crônica S. A infecção por ΔAroA de typhimurium é um modelo robusto do rato da fibrose intestinal que pode oferecer introspecções na patogénese de características CD-like.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade da Colúmbia Britânica. 1. preparação de culturas de Salmonella typhimurium ΔAroA para gavagem oral de camundongos De um estoque congelado de glicerol de S. Typhimurium ΔAroA, prepare uma placa de raia usando o agar LB contendo 100 μg/mL de estreptomicina com um laço de inocular estéril. Incubar durante a noite a 37 ° c. As placas de raia podem ser armazenada…

Representative Results

Tratamento com estreptomicina seguido de infecção oral por S. O δaroa de typhimurium conduz à inflamação e à fibrose intestinais robustas especialmente no ceco (Figura 1). Os fardos patogénicos típicos de 108 a 109 UFC por 1 g de ceco e 104 CFU por 1 g de baço podem ser recuperados de animais infectados (Figura 2). A avaliação da fibrose em secções cecais coradas de picrosirius indica fibrose de pico 21 dia…

Discussion

Nossa compreensão da patogénese de IBD foi aumentada extremamente por modelos do rato da inflamação intestinal. Embora tais modelos individuais não Recapitulem todas as características da doença humana complexa e multifatorial, têm sido úteis na identificação de características-chave da progressão da doença. As estenoses fibrotic associadas com o IBD remanesce uma necessidade clínica não atendidas principal porque os tratamentos atuais são ineficazes em inverter o desenvolvimento da doença. Além disso,…

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM