Infección crónica por salmonela fibrosis intestinal inducida

Summary

Este protocolo describe un modelo de ratón de fibrosis intestinal impulsada por Salmonella que se asemeja a las principales señas de identidad patológicas de la enfermedad de Crohn, incluida la inflamación transmural y la fibrosis. Este método se puede utilizar para evaluar los factores de huésped que alteran los resultados fibroticos utilizando ratones mutantes mantenidos en un fondo genético C57Bl/6.

Abstract

La fibrosis tisular caracterizada por la acumulación patológica de la matriz extracelular como el colágeno es el resultado de la inflamación persistente y la reparación desregulada. En la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la fibrosis conduce a formaciones recurrentes de estenosis para las que no hay una terapia eficaz que no sea la resección quirúrgica. Debido a su inicio tardío, los procesos que impulsan la fibrosis son menos estudiados y en gran medida desconocidos. Por lo tanto, las complicaciones fibrosas representan un desafío importante en la EII. En este protocolo, se describe un modelo robusto in vivo de fibrosis intestinal donde el pretratamiento de estreptomicina de ratones C57Bl/6 seguido de gavage oral con el grado de vacuna Salmonella Typhimurium AaroA mutante conduce a la colonización persistente de patógenos y fibrosis del cecum. Metodologías para la preparación de S. Se explica Typhimurium -AroA para la inoculación, la cuantificación de las cargas de patógenos en el cecum y el bazo, y la evaluación de la deposición de colágeno en los tejidos intestinales. Este modelo de enfermedad experimental es útil para examinar factores de huésped que mejoran o exacerban la fibrosis intestinal similar a la CD.

Introduction

La colitis ulcerosa (UC) y la enfermedad de Crohn (CD) son las dos formas principales de EII y se caracterizan como trastornos inflamatorios crónicos y recurrentes del tracto gastrointestinal ^1,2. Estos trastornos tienen un impacto importante en la calidad de vida de los pacientes. Los síntomas de la EII incluyen dolor abdominal, diarrea, náuseas, pérdida de peso, fiebre y fatiga^3. Estudios recientes han identificado factores genéticos y ambientales que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad; se cree que tales factores de riesgo contribuyen a la interrupción de la barrera epitelial que resulta en la translocación o sobremuestreo de antígenos luminales⁴. Como consecuencia, esto inicia una respuesta inflamatoria aberrante a la flora commensal mediada por las células inmunitarias intestinales^4. Las características de las complicaciones asociadas a la EII pueden extenderse a sitios más allá del tracto gastrointestinal que afectan a varios órganos, incluyendo articulaciones, piel, y el hígado^1,2. Las características de la UC incluyen inflamación grave y difusa típicamente localizada en el colon¹. La patología de la enfermedad afecta a la mucosa y la submucosa del intestino, lo que resulta en ulceraciones superficiales de la mucosa¹. Por el contrario, la CD puede afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal, aunque la evidencia de la enfermedad se encuentra comúnmente en el colon y el íleon distal^2. Por otra parte, la inflamación en CD es transmural, afectando a todas las capas de la pared intestinal².

Varios genes de susceptibilidad de la EII que se han identificado indicarían que la desregulación de la barrera epitelial o la inmunidad son contribuyentes críticos a la progresión de la enfermedad⁵. Se encontró que las mutaciones en el dominio 2 de oligomerización de nucleótidos (NOD2) expresadas por monocitos estaban asociadas con una mayor susceptibilidad a la CD; esto pone de relieve un vínculo entre la detección inmune innata alterada de los componentes bacterianos y la enfermedad^6. Estudios de asociación más recientes del genoma (GWAS) han revelado vías adicionales potencialmente implicadas en la patogénesis de la EII, incluidas variaciones genéticas en: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R vinculada a la inmunidad adaptativa, MUC1, MUC19y PTGER4 en el mantenimiento de barreras intestinales, y la autofagia mediada ATG16L^7,8,9. Si bien estos estudios genéticos basados en la población han mejorado nuestra comprensión de la EII, es probable que los alelos de susceptibilidad por sí solos sean insuficientes para iniciar y mantener la enfermedad crónica³. Otros factores no genéticos, incluyendo alteraciones en la composición del microbioma intestinal y una reducción en la diversidad se han asociado con la inflamación intestinal. Sin embargo, no está claro si la disbiosis intestinal precede o es la consecuencia de las respuestas inmunitarias desreguladas³. Aunque la etiología de la EII sigue sin estar clara, nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad se ha visto reforzada por modelos experimentales de ratón de inflamación intestinal^10,11. Estos modelos individualmente no representan plenamente la complejidad de la enfermedad humana, pero son valiosos para esclarecer vías fisiopatológicas que podrían ser relevantes para la EII y para la validación de estrategias terapéuticas tentativas^{10, 11}. Estos modelos de ratón suelen basarse en el inicio de la inflamación por inducción química o infección, transferencia de células inmunitarias o manipulación genética. Además, estas estrategias a menudo implican perturbaciones en la integridad epitelial o modulación de inmunidad innata o adaptativa.

Los seróvares enterica sándalos de Salmonella son patógenos intestinales que pueden infectar a humanos y ratones. Después de la ingestión, Salmonella puede colonizar el intestino por invasión directa de epitelia, células M, o antígeno que presenta las células¹². Ratones infectados por vía oral con S. Typhimurium da como resultado la colonización principalmente de sitios sistémicos como el bazo y los ganglios linfáticos mesentéricos con relativamente baja abundancia en el tracto gastrointestinal^12. Sin embargo, el pretratamiento de ratones con estreptomicina mejora la eficiencia de la colonización de Salmonella del intestino al disminuir los efectos protectores del huésped de la microbiota normal^13. Las características patológicas de este modelo incluyen la interrupción o ulceración de la barrera epitelial, el reclutamiento de granulocitos y el edema grave^13. Alternativamente, infección con la vacuna grado S. El mutante Typhimurium -AroA conduce a la colonización crónica del cecum y el colon que persiste hasta el día 40 después de la infección¹⁴. El S. La cepa Typhimurium -AroA tiene un defecto en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos; esto hace que la cepa mutante avirulemente y se puede utilizar como una vacuna altamente eficaz¹⁵. La infección oral en ratones conduce a una respuesta inflamatoria asociada a Th1 y Th17-citoquina, remodelación extensa del tejido y deposición de colágeno. La patología tisular se asocia con niveles elevados de factor profibrotico como TGF-1, CTGF e IGF^14. La cicatrización fibrosa transmural notificada en este modelo recuerda a las formaciones de estenosis que a menudo se observan en la EII. La inducción de fibrosis por Salmonella requiere virulencia codificada por las islas de patogenicidad de Salmonella (SPI)-1 y 2 ¹². Es importante destacar que esta S. El modelo de infección de Tymphimurium -AroA es un sistema útil para el estudio de respuestas fibrosas en ratones mutantes mantenidos en un fondo C57/Bl6. La cepa C57/Bl6 es extremadamente sensible a S. Infección por Typhiumurim SL1344 debido a una mutación de pérdida de función en el gen que codifica la proteína de macrófago sasociado a la resistencia natural (NRAMP)-1^16,17. Hemos encontrado que las células linfoides innatas dependientes de IL-17A y ROR son importantes contribuyentes a la patogénesis en este modelo^18.

Una complicación importante de la CD es la deposición desregulada y excesiva de la matriz extracelular (ECM) incluyendo colágeno^2,19. Aunque el tracto gastrointestinal tiene una capacidad relativamente alta de regeneración, la cicatrización fibrosa puede surgir debido a las respuestas curativas de heridas no resueltas que se asocian con inflamación crónica y grave^20,21. En CD, esto resulta en efectos nocivos en la arquitectura del tejido que conduce a un deterioro significativo del órgano^21,22. La naturaleza transmural de la inflamación observada en cd en última instancia precede al engrosamiento de la pared intestinal asociada con la estenosis sintomática o formación de estenosis^21. Alrededor de un tercio de los pacientes con CD requieren resección intestinal para esta complicación²². No existen terapias antifinosfóticas eficaces en la EII, dado que el uso de inmunosupresores como los productos biológicos de azatioprina o anti-TNF no tienen ningún impacto o sólo redujeron modestamente el requisito de intervenciones quirúrgicas^19,23 . Mientras que la fibrosis se cree que es la consecuencia de la inflamación crónica, las células de origen mesenquimal como los fibroblastos y los pericitas se cree que son las principales fuentes celulares de ECM en cicatrices fibrosas^21,24. Crónica S. La infección por Typhimurium -AroA es un modelo robusto de ratón de fibrosis intestinal que puede ofrecer información sobre la patogénesis de características similares a los CD.

Protocol

Todos los protocolos de los animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica. 1. Preparación de salmonella Typhimurium -AroA cultivos para el gavage oral de ratones De un stock de glicerol congelado de S. Typhimurium -AroA, prepare una placa de rayas con agar LB que contenga 100 g/ml de estreptomicina con un bucle inoculante estéril. Incubar durante la noche a 37oC. Las placas de rayas se pueden almacenar has…

Representative Results

Tratamiento con estreptomicina seguido de infección oral con S. Typhimurium -AroA conduce a inflamación intestinal robusta y fibrosis especialmente en el cecum (Figura 1). Las cargas patógenas típicas de 108 a 109 UFC por 1 g de cecum y 104 UFC por 1 g de bazo se pueden recuperar de animales infectados(Figura 2). La evaluación de la fibrosis en las secciones cecales manchadas de color rojo picrosirius indica fibrosi…

Discussion

Nuestra comprensión de la patogénesis de la EII se ha visto reforzada en gran medida por los modelos de ratón de inflamación intestinal. Aunque estos modelos individuales no recapitulan todas las características de la enfermedad humana compleja y multifactorial, han sido útiles para identificar las características clave de la progresión de la enfermedad. Las estenosis fibrosas asociadas con la EII siguen siendo una necesidad clínica importante no satisfecha, ya que los tratamientos actuales son ineficaces para r…

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM